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北大核心 CSTPCD CSCD CBST
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摘要:对来源于大肠杆菌的植酸酶基因 appA进行突变获得植酸酶基因突变体 appA-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌 GS115/appA-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L 发酵罐中进行高密度发酵147 h 后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102 h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L,酶活性(发酵效价)为2.03×105 U/mL。结果表明,通过高密度发酵提高了产植酸酶 appA-2QN 的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,揭示该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。...
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北大核心 CSTPCD CSCD CBST
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摘要:为探讨N-糖基化对植酸酶phy( QF )酶学性质的影响,将植酸酶基因phy( QF )在毕赤酵母中进行了表达,利用脱糖基化酶Endo Hf去除重组植酸酶phy(QF)的糖链,对去除糖链前后的植酸酶phy(QF)进行了纯化和酶学性质研究与比较。结果表明,糖基化的植酸酶phy(QF)分子量约为53 kDa,酶活为3201 U/mg,Km =392μmol/L,Vmax =3267 U/mg;糖基化的植酸酶phy( QF )最适pH值为4.5,最适反应温度为55℃,与去糖基化的植酸酶phy( QF )的最适pH值无明显区别,比去糖基化的植酸酶phy(QF)最适温度提高了5℃,Tm值提高约2℃。经70℃孵育10 min后,去糖基化的植酸酶phy(QF)完全失活,而糖基化的植酸酶phy(QF)仍残留13%的活性,说明N-糖基化作为一种重要的翻译后修饰,对植酸酶phy( QF )的稳定性有促进作用。...
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北大核心 CSTPCD CSCD CA EI CBST
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摘要:为提高大肠杆菌植酸酶AppA(一种已得到广泛应用的饲料添加剂,其酶活高,pH作用范围广,但热稳定性较差)热稳定性,在appA基因上组合突变了W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10个位点,突变后的基因命名为appAM10.将野生型appAppA和突变体appAM10ppAM10基因转入毕赤酵母GS115进行表达,并对重组蛋白AppA和AppAM10进行了酶学性质研究与比较.结果表明:AppAM 10分子量约为55kDa,比活性为3022U/mg,AppAM10的Km=330μmol/L,Vmax=3147 U/mg.AppAM10的最适pH值为4.5,最适反应温度为65℃.与野生型的AppA的最适pH无明显区别,比AppA的最适温度提高了5℃.经90℃孵育15min后,AppA完全失活,而AppAM10仍残留17.5%的活性,Tm值提高约8℃,说明上述10个位点的组合突变有利于提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性,其中与N-糖基化有关的N204C、Q258N和Q349N3个位点可能起着重要作用....
摘要:为比较在不同宿主中表达的大肠杆菌植酸酶突变体appAM8的性质,将appA M8基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中进行表达,对纯化后的植酸酶进行酶学性质分析与比较.结果显示:(1)在大肠杆菌中表达的appAM8 (E-appAM8)和酵母中表达的appAM8 (P-appAM8)的最适pH值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的appA的最适pH无明显区别,比appA的最适温度高了5℃;(2)经SDS-PAGE检测,E-appAM8分子量(Mr)大小为47×103,而P-appAM8为53×103左右,由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;(3)在60-80℃之间,E-appAM8的热稳定性性明显下降,而且在70 ℃处理15 min后,E-appAM8残余活性仅为4%,而P-appAM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了酶的热稳定性.(4)E-appAM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196 U/mg,P-appAM8的Km=0.36 mmol/L,Vmax=3333 U/mg.本研究表明,糖基化修饰对植酸酶appAM8的热稳定性起着重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起到了一定作用....
[硕士论文] 宋玛丽
生物工程 山西大学 2015(学位年度)
摘要:植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸。在食品和饲料中添加植酸酶可促进营养物质的利用,降低磷排出,对减少环境污染有重要意义。来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶之一,然而如何提高植酸酶的热稳定性是植酸酶规模化生产所面临的一个主要问题。
  本实验室利用基因工程手段,对大肠杆菌植酸酶基因appA进行了定点突变,得到植酸酶基因突变体appAM8。前期结果显示,在酵母中表达后与野生型appA相比,appAM8热稳定性有明显提高。为了进一步探讨植酸酶耐热机理,本研究将该突变体基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达,将获得的蛋白与酵母表达的植酸酶进行了酶学性质研究与比较。结果显示:1)在大肠杆菌中表达的 appAM8(E-appAM8)和酵母中表达的appAM8(P-appAM8)两个植酸酶的最适pH值均为4.5,最适反应温度均为65℃,与野生型的appA的最适pH无明显区别,比appA的最适温度高了5℃;2)经SDS-PAGE检测,E-appAM8分子量大小为47 kDa,而P-appAM8为53 kDa左右,并且由于在酵母中的糖基化修饰电泳显示为两条带;3)在60℃-80℃之间,E-appAM8的耐热性明显下降。而且在70℃处理15 min后, E-appAM8残余活性仅为4%,而P-appAM8仍保留50%的残余活性,表明酵母表达的植酸酶经过糖基化修饰后提高了它的热稳定性;4)E-appAM8的Km=0.245 mmol/L,Vmax=3196U/mg,而P-appAM8的Km=0.36mmol/L,Vmax=3333U/mg。本研究通过比较不同宿主中表达的植酸酶的性质,表明糖基化修饰对植酸酶appAM8的热稳定性起重要作用,8个位点的突变对该植酸酶的稳定性也起一定作用。
  另一方面,对来源于大肠杆菌的植酸酶基因 appA进行突变,获得植酸酶基因突变体 appA-2QN。利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,本研究对表达该酶的重组酵母菌GS115/appA-2QN进行了高密度发酵研究。通过控制发酵过程中的碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,本实验利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度经检测,OD600 nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导102h后,蛋白达到了较高的表达量,为7.06 g/L;酶活性(发酵效价)为2.03×105 U/mL。这些数据说明,通过高密度发酵提高了产植酸酶appA-2QN的酵母工程菌的细胞生长密度和蛋白质表达量,该重组酵母菌株具有良好的表达稳定性。
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