绑定机构
扫描成功 请在APP上操作
打开万方数据APP,点击右上角"扫一扫",扫描二维码即可将您登录的个人账号与机构账号绑定,绑定后您可在APP上享有机构权限,如需更换机构账号,可到个人中心解绑。
欢迎的朋友
万方知识发现服务平台
获取范围
  • 1 / 1
  (已选择0条) 清除 结果分析
找到 1 条结果
[博士论文] 宋晓雯
生物学;动物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:DNA甲基化胞嘧啶作为一种重要的表观遗传修饰,广泛存在于绝大多数真核生物中,可参与调节多种重要的生物学过程,包括胚胎发育,X染色体失活,基因印迹,基因选择性拼接及癌症发生等等。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),越来越多物种单碱基分辨率全基因组甲基化图谱得到破译,了解甲基化胞嘧啶位点在生物体基因组的具体分布规律及特点将有助于进一步探究其生物学功能。赤拟谷盗作为一种重要的模式生物,其全基因组序列已于2008年获得破译,由于其具备高效RNAi效率,被广泛用于生命科学研究的各个领域,是研究基因功能的良好材料。由于赤拟谷盗基因组仅含有两种甲基化转移酶DNMT1,DNMT2,缺失从头甲基化转移酶DNMT3,因此关于其基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点,至今尚未定论,那么赤拟谷盗基因组是否含有甲基化胞嘧啶位点?若有,其具体分布规律及特点是怎样的?它的具体形成机制及作用机制是什么?最重要的是,它在赤拟谷盗正常生命发育过程中发挥怎样的生物学功能?针对以上问题,本研究首先利用亚硫酸氢盐转化结合高通量测序技术(BS-seq),获得了赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实了甲基化胞嘧啶位点的存在,分析了其在基因组具体分布规律,同时结合RNA-seq,探究赤拟谷盗甲基化位点对基因表达调控作用。随后鉴定赤拟谷盗体内甲基化转移酶,利用RNAi技术,电泳凝胶迁移率实验及BSP技术,阐明赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点具体形成机制及其生物学功能,最后鉴定赤拟谷盗甲基DNA结合蛋白,利用RNAi,体外重组蛋白表达及电泳凝胶迁移率实验探究了赤拟谷盗DNA甲基化发挥作用的具体机制。
  研究结果表明赤拟谷盗不同生命发育时期包括卵,幼虫,蛹及成虫,均含有甲基化胞嘧啶位点,但数量较少,约占基因组胞嘧啶位点总数0.1%-0.2%,且随着生命发育的成熟,基因组甲基化水平呈上升趋势。赤拟谷盗基因组中含有两种类型甲基化胞嘧啶位点:大量的非CpG甲基化位点及少量的对称分布的CpG甲基化位点。非CpG甲基化位点在基因组中占主导地位,其中又以CpA甲基化位点居多,集中分布在基因间区,内含子区域,重复子序列远离基因主体区域分布,基因主体区域非CpG位点甲基化水平对于基因表达起负调控作用。而少量的对称分布CpG甲基化位点,其分布规律遵循真核生物甲基化组一般特点,甲基化CpG位点集中分布在基因主体区域,对基因表达起正调控作用。赤拟谷盗不同发育时期甲基化图谱高度相关,仅存在少量不同甲基化区域(DMR),对DMR区域基因进行功能注释,结果显示与生殖,发育,转录等相关众多的关键基因均存在于DMR区域,暗示赤拟谷盗DNA甲基化对于其生命周期转换起着十分重要的调控作用。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何建立的呢?本研究随后鉴定并克隆赤拟谷盗甲基化转移酶基因并探究其具体作用机制,结果发现赤拟谷盗体内含有两种甲基化转移酶基因Tcdnmt1,Tcdnmt2,Tcdnmt1含有两种选择性拼接本,Tcdnmt1a,Tcdnmt1b,缺失从头甲基化转移酶基因dnmt3,保守功能结构域分析结果表明Tcdnmt1a含有与其他物种一致功能结构域包括N端调节结构域及C端催化结构域,而Tcdnmt1b缺失了C端催化结构域,该功能域主要负责催化甲基化胞嘧啶位点的形成,这一区域缺失暗示TcDNMT1b可能丧失催化甲基化胞嘧啶形成的能力。Tcdnmt2含有与其他物种一致保守功能结构域,暗示其可能具备与其他物种一致保守的生物学功能。与此相一致,甲基化转移酶体外催化活力检测实验发现,TcDNMT1a,TcDNMT1b均能够特异性结合CpG位点,但仅有TcDNMT1a能够特异性催化半甲基化CpG位点的甲基化,说明其具备维持甲基化转移酶功能,而TcDNMT1b丧失了催化甲基化CpG位点形成的能力。TcDNMT2不能结合DNA底物,暗示其不能参与赤拟谷盗DNA甲基化形成,可能负责基因组tRNA甲基化,当然这有待于进一步探究。利用RNAi技术,敲减甲基化转移酶基因在体内表达,发现Tcdnmt1a缺失造成赤拟谷盗变态发育缺陷及胚胎致死,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2缺失对赤拟谷盗正常生命发育无明显影响,暗示DNA甲基化对于赤拟谷盗变态发育及早期胚胎发育具有十分重要的调控作用,此外,Tcdnmt1a敲减后,赤拟谷盗体内CpG甲基化位点甲基化水平发生明显降低,而Tcdnmt1b,Tcdnmt2敲减后对此无影响,体内证据进一步支持赤拟谷盗TcDNMT1a负责CpG位点的甲基化。而对于其体内广泛存在的非CpG甲基化位点,可能存在一种新颖甲基化转移酶负责该类型甲基化位点的形成。
  赤拟谷盗这种新颖的甲基化分布形式是如何发挥生物学功能的呢?甲基DNA结合蛋白作为表观遗传系统重要调控因子,其能够特异性结合CpG甲基化位点,同时结合下游组蛋白复合物,通过改变染色质构像,基因印迹,激活或者抑制基因表达,从而将DNA甲基化编码遗传信息转化为相应的生物学功能。本研究鉴定赤拟谷盗编码甲基DNA结合蛋白基因Tcmbd2/3,该基因与人类mbd2,mbd3高度同源,保守功能结构域分析结果表明,该蛋白含有MBD_a,MBD_c功能结构域,这两个功能结构域主要负责与核小体重塑及组蛋白脱乙酰化酶复合物(NuRD)互作,而缺失部分甲基DNA结合功能域(MBD),这一功能域主要负责与甲基化CpG位点结合,该区域缺失,暗示TcMBD2/3丧失结合甲基化CpG位点的能力,利用RNAi技术敲减该基因在赤拟谷盗体内表达发现,Tcmbd2/3缺失造成了一系列致死表型,包括中期幼虫蜕皮停滞,晚期幼虫变态失败,蛹形态异常,不能羽化为成虫,最有趣发现是Tcmbd2/3缺失成虫表现出严重神经缺陷包括自主运动能力逐渐丧失,下降的食量及体重等等,此外,Tcmbd2/3缺失雌虫丧失了产卵能力。利用电泳凝胶迁移率实验检测TcMBD2/3蛋白对CpG及非CpG甲基化位点结合能力,结果发现,TcMBD2/3与两者均无结合,说明赤拟谷盗仅存少量的对称分布CpG甲基化位点不需要通过TcMBD2/3发挥生物学功能,而大量非CpG甲基化位点可能通过其他蛋白因子发挥生物学功能,这有待于进一步研究。
  本研究首次鉴定赤拟谷盗不同生命发育时期单碱基分辨率全基因组甲基化图谱,证实赤拟谷盗基因组甲基化胞嘧啶位点的存在,并阐明其具体分布规律及特点,同时鉴定其体内甲基化转移酶及甲基DNA结合蛋白,通过探究其具体生物学功能,揭示了赤拟谷盗甲基化胞嘧啶位点形成机制,作用机制及生物学功能。
  (已选择0条) 清除
公   告

北京万方数据股份有限公司在天猫、京东开具唯一官方授权的直营店铺:

1、天猫--万方数据教育专营店

2、京东--万方数据官方旗舰店

敬请广大用户关注、支持!查看详情

手机版

万方数据知识服务平台 扫码关注微信公众号

万方选题

学术圈
实名学术社交
订阅
收藏
快速查看收藏过的文献
客服
服务
回到
顶部