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[硕士论文] 安雪敏
果树学 河北农业大学 2018(学位年度)
摘要:黄金梨是引自韩国的新品种,属砂梨系统,具有非常重要的经济和商品价值。由于黄金梨成熟后易软化,货架期也随之相应缩短,黄金梨的储存和运输成为阻碍其市场发展的主要因素之一。乙烯信号转导相关基因与果实成熟衰老密切相关,作为本试验的研究重点。而黄金梨的基因组大而复杂的特点给研究过程增加了难度。CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因编辑技术,由于具有简单、快捷、灵活等优点,被广泛应用于各种动、植物及微生物的基因编辑研究中。
  本试验以华南农业大学刘耀光教授课题组提供的载体构建方法及相关质粒构建了黄金梨PpERS1、PpERF1和PpERF2基因相应的CRISPR/Cas9表达载体,为了对表达载体进行体外验证,对叶片原生质体的制备及转化进行了初探。同时以黄金梨组培苗为试材,采用离体组织培养的方法,对离体的黄金梨叶片再生体系进行了探究,进而构建了黄金梨的遗传转化体系。并利用根癌农杆菌介导的方法对黄金梨离体叶片进行了遗传转化相关研究。主要研究结果如下:
  1.建立了黄金梨离体叶片再生体系。比较了2种基本培养基,MS和NN69,NN69基本培养基适合黄金梨离体叶片的再生。对16种愈伤组织诱导培养基进行了比较,16号培养基(NN69+琼脂7.5g/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L)对不定芽的再生有很好的促进作用,愈伤组织出芽率可达到52.50%。一定时间的暗培养也能促进黄金梨不定芽的再生,暗培养时间为21天时的处理效果最佳。
  2.构建了黄金梨PpERS1、PpERF1和PpERF2基因CRISPR/Cas9植物表达载体UH1、UH2和UH3。用Overlapping PCR的方法构建单个sgRNA表达盒,再将sgRNA表达盒和质粒YLCRISPR/Cas9Pubi-H经限制性内切酶Bas I与T4连接酶共同作用,得到以潮霉素作为筛选标记基因的植物表达载体UH1、UH2和UH3,并用化学热激法导入根癌农杆菌EHA105。
  3.建立了黄金梨的遗传转化体系。在转化体系中,共培养基为NN69+琼脂7.5g/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L,共培养时间为3天;预筛选培养基为NN69+琼脂7.5g/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L+150mg/L Timentin,预培养的暗处理时间为7天;筛选培养基为NN69+琼脂7.5g/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+NAA0.1mg/L+150mg/L Timentin+3mg/LHyg,筛选培养的暗处理时间为21天;此后进行正常的光照培养。
  4.对黄金梨叶片原生质体的制备及转化进行了初探。研究了本试验中所用酶解液的酶解时间,对制备原生质体的影响,12h时酶解效率最高。通过PEG介导的方法将带有EGFP的质粒成功转化到黄金梨叶片原生质体中,为CRISPR/Cas9系统在黄金梨的体外表达研究作铺垫。
  5.用含有植物表达载体UH3的根癌农杆菌对黄金梨离体叶片进行了遗传转化研究。获得了2棵潮霉素抗性黄金梨组培苗。
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