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[博士论文] 孙夫德
化学工程与技术 北京化工大学 2018(学位年度)
摘要:细胞膜不仅是细胞得以独立存在的基本单元,也是多种生命活动的承载平台。重要的信号转导、物质交换及免疫应答等过程依赖细胞膜上相关蛋白质的自组装过程。膜蛋白通过跨膜区自组装是其表达生物活性的常见形式。跨膜区聚集体的形成、结构维持与转变不仅响应蛋白膜外区的结构变化,也直接参与到各种信号转导过程。与此同时,细胞膜作为膜蛋白存在或依附的环境主体,膜组分多样性以及结构异质性所形成的微环境,不仅是影响膜蛋白相互作用的重要因素,也成为决定自组装性多肽药物靶向作用的重要特性。
  受制于实验条件下蛋白提取、纯化以及表征上的局限性,传统的技术手段仍难以提供细胞膜条件下精微的蛋白作用信息。分子动力学模拟得益于高精度及动态可视化的特点,已被广泛应用在分子生物学领域。经过进一步原子整合所形成的粗粒化力场,既确保了模拟的精确性,又有效拓展了体系容量及模拟时长,为有关大分子相互作用研究提供了高通量、近原子级的动态模拟结果。
  本文中,依据相关实验结果,配合一定实验手段,利用分子动力学模拟的方法,探究细胞膜体系中膜蛋白跨膜区自组装与构象、膜环境介导的异源蛋白相互作用、以及自组装性活性肽干扰下的膜耐受性等内容。本文研究通过构建不同条件的膜环境,利用多种分析手段和方法,综合阐释了与膜蛋白功能表达相关的自组装特性、结构转变、膜定位与转移等研究内容,具体如下:
  (1)结合粗粒化模拟以及全原子模拟条件,对酪氨酸激酶受体EphA2跨膜区二聚机制进行了深入分析。研究发现其跨膜区能形成两种可彼此转变的二聚体构象。其中,调控形成左手平行构象的接触面为L535xxxG539xxA542xxxV546xxL549xxxG553以及FF557,与NMR结果一致;而其N端的G540xxxG544参与形成右手20°构象,符合已有实验结果。另外,FF557之间能够形成稳定的“铆合”结构,表现出与上游序列同等调控左手平行构象的能力,并扮演着二聚体构象转化的纽带。研究同时发现,H559通过锚定细胞膜极性头部,有利于左手平行构象的稳定。模拟结果系统全面的揭示了跨膜区二聚的结构信息,增强了对构象有机转换以及膜调控的理解。
  (2)通过构建包含脂筏的两相态细胞膜结构,深入阐释了淀粉样前驱蛋白跨膜区段(C99)在脂筏介导下的聚合以及淀粉样化表达。结果发现脂筏微区域不仅抑制了C99二聚能力,也显著影响了其二聚后的构象特征。这不仅涉及胆固醇与C99聚合位点的竞争性结合,也包含饱和磷脂分子对于C99在脂筏边缘的锚定作用。脂筏影响下的C99单体和二聚体显著改变了其关键淀粉样位点的酶识别能力,从而潜在影响了其淀粉样化途径。研究结果全面阐述了胆固醇、脂筏以及淀粉样化降解途径的内在关联,对于理解老年痴呆症的发病机理有启发意义。
  (3)细胞膜微环境在跨膜蛋白与胞质蛋白受体的结合过程中发挥着重要作用。通过构建不同内层组分的磷脂双分子层体系,发现负电磷脂分子是引导胞质蛋白受体贴附于细胞膜表面的必要条件。值得注意的是,在同等电荷浓度下,磷脂酰肌醇-3,4二磷酸(PIP2)能够显著的促进跨膜蛋白与胞质受体的结合效率,并且形成结构更稳定的异源蛋白复合物。PIP2依赖静电引力在蛋白周围聚集,而异源蛋白复合物的最终形成则得益于PIP2聚集体进一步的融合。研究结果揭示了在膜内层表面区域,蛋白相互作用受特异膜分子介导的分子机制,有利于增强对膜环境诱导膜蛋白间识别与结合的理解。
  (4)膜-蛋白在膜表面的相互作用进一步体现在自组装性多肽扰乱膜结构的过程中。通过构建具有病原细胞特性的膜模型,发现自组装性活性肽PTP-7b须首先以单体形式嵌入膜后,在一定的浓度条件下,方能与膜分子发生共聚集,导致明显的局部膜形变。PTP-7b依赖膜嵌合多肽的前导性自组装,以及膜周质多肽的后续牵引作用,形成“笼”状结构将脂质分子抽离出细胞膜基质,呈现出一种崭新的裂解细胞膜模式。PTP-7b自组装破坏细胞膜的驱动力除了组氨酸相互作用外,也来自于多肽两亲特性的调控。相关研究全面解析了自组装性裂解肽活性表达的自组装条件、模式及分子机制,对于生物活性肽设计以及优化有指导意义。
  综上所述,本文深入阐释了膜蛋白自组装内在机理及膜微环境调控,论述了其生物功能表达的调控机制。本论文所揭示的自组装过程、动态转换机制以及作用模式等分子信息,能够为相关膜蛋白的研究深化提供参照。
摘要:膜环境调控下的蛋白转运及相互作用是研究生命科学的基础内容。脂筏1 作为细胞膜中富含胆固醇和鞘磷脂的独特微区,对多种膜蛋白尤其跨膜蛋白参与的神经退化性疾病、免疫及肿瘤具有十分广泛的影响。针对脂筏在微观条件下调控跨膜蛋白相互作用的特点,课题组建立了关键实验技术和分子动力学理论模拟等研究方法2-3,探究膜环境中蛋白相互作用和结构转化的分子机制及其与相关疾病之间的潜在联系。
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