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[硕士论文] 姜磊
临床兽医学 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)存在半衰期短,容易失活,内出血风险等问题,而我们进行相应改造的重组人组织纤溶酶原激活剂(rhPA)则具有半衰期延长、产量提高、与人体相容性高等优点。本实验室构建的重组PCL25/rhPA表达载体内含有CMV增强子调控元件以及获得的转基因纯合子兔整合拷贝数2倍于半合子,导致了其高效表达的能力,表达产量及活性的提高,有助于表达水平较高的转基因兔进行纯合子培育及传代扩系。现阶段目前临床上应用的t-PA及其突变体大多是在原核大肠杆菌中表达,少部分由动物或昆虫细胞表达,从乳汁中分离纯化rhPA尚未见报道。我利用多种纯化手段,研究从转基因兔乳中将rhPA分离出来的方法,从而确保从转基因兔乳中纯化的rhPA的纯度、生物活性及稳定性。
  乳腺特异性表达rhPA转基因兔的筛选与繁育将山羊BLG信号肽编码区和人t-PA的K2和P结构域的编码序列克隆到含有山羊β-酪蛋白基因的5'基因组片段和CMV启动子/增强子的PCL25载体中作为嵌合启动子/增强子,构建了PCL25/rhPA乳腺特异性表达载体。经原核显微注射PCL25/rhPA表达载体线性片段后,共获得存活仔兔48只,经PCR检测整合阳性兔27只。对F0代转基因兔乳清进行ELISA检测并测定OD450值,结果获得11只能在乳腺中表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔。通过对F2代转基因兔测交后代的检测,筛选出4只转rhPA基因纯合子兔(编号C1-C4)。将纯合子兔与半合子兔乳清样品进行ELISA检测并测定OD450值,发现转基因纯合子兔乳清中rhPA的表达量明显高于半合子转基因兔乳清中的表达量。通过FAPA法将获得的转基因兔乳清稀释后与注射用阿替普酶药物比较,结果显示表达rhPA的转基因纯合子兔与半合子兔乳清均在纤维蛋白平板上产生了明显的溶栓透明圈,均具有溶栓活性功能,但纯合子转基因兔溶栓活性强于半合子转基因兔。对转基因兔乳清进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析,检测发现rhPA转基因兔乳清中含41KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。
  表达产物rhPA的纯化与分析经20000g离心、35%饱和硫酸铵沉淀、酸碱沉淀及超滤等乳样前处理后,除去了如酪蛋白、脂肪等不溶性物质及大部分的盐离子和小分子物质,再利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等方法进一步分离纯化rhPA。发现采用0.5mol/L L-Arg+0.5mol/L Nacl的25mmol/L PB缓冲液(pH5.5)洗脱液进行Lysine HyperD亲和层析时能将大部分目标蛋白洗脱下来;Blue Sepharose6FF亲合层析时,通过阶段梯度洗脱后发现采用0.4mol/L NaCl的25mmol/L PB缓冲液(pH8.0)淋洗再用1mol/L NaCl的25mmol/L PB缓冲液(pH8.0)洗脱时能将杂蛋白去除的同时洗脱下目标蛋白。SP BestaroseTM FF离子交换时,通过线性梯度洗脱后发现采用0.3mol/L NaCl的20mmol/L PB缓冲液(pH5.0)淋洗再用1mol/L NaCl的20mmol/L PB缓冲液(pH5.0)能分离出目标蛋白。最后应用Surpdex G75凝胶过滤预装柱进一步精细分离纯化目标rhPA。各层析方法洗脱产物经FAPA法检测均具有生物活性且未失活;同时各层析方法洗脱产物经平衡液置换后进行SDS-PAGE检测均出现约41KDa大小的rhPA目标蛋白条带。转基因兔乳汁经多种纯化方法提纯后的纯化产物,经ELISA半定量与原乳清比较计算回收率为30%。运用Quantity One1-D分析软件进行SDS-PAGE纯度分析,纯化后纯度达96%以上。Western Blot检测纯化产物中含有41KDa左右条带,与目标蛋白rhPA的大小相符。获得的最终纯化产物通过FAPA法比较其与注射用阿替普酶药物在体外的溶栓生物活性的比活性,结果发现纯化产物在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行相对分子质量分析测定,结果显示该纯化产物与提供的理论序列比对结果相符,分子量大小为41713Da。rhPA的N-和C-末端蛋白质序列测定表明纯化的蛋白质是完整的,进一步确定该纯化产物为重组人纤溶酶原激活剂。
  本研究筛选出了能在乳腺中高表达rhPA的PCL25/rhPA表达载体转基因兔,并以此为基础培育的该品系转基因纯合子兔rhPA的表达量及体外溶栓活性均高于半合子转基因兔。本试验通过多种纯化技术相结合的方法,最终获得在保持高效的体外溶栓生物活性功能的同时比活性是注射用阿替普酶药物的150倍左右的纯化产物rhPA,为之后的纯化研究提供了新的思路。
摘要:自上世纪以来,血栓性疾病一直是危害人类健康和生命安全的头号因素,溶栓疗法是目前临床上使用最广泛而有效的一种治疗方法,而且溶栓药物已经历了三代发展.重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)是一种丝氨酸蛋白酶,能够高效特异地溶解血栓,属的第三代溶栓药物.本研究构建了rhPA乳腺特异性表达载体,应用到转基因兔制备一种新颖、高效的溶栓药物.相关研究方法和结果如下:在获得rhPA表达兔(1mg/mL)以上的基础上,应用3株自制的高效价小鼠单克隆抗体制备亲和层析柱.通过离心脱脂、饱和硫酸铵沉淀、超滤及透析等兔乳前处理,获得粗纯品.将C4株抗体与CNBr activated Bestarose 4FF偶联来制备免疫亲和层析柱.0.75mol/L硫酸铵+40%丙二醇的TE缓冲液(pH7.9)洗脱获得半纯品.Sephedex75凝胶过滤纯化目标蛋白,获得纯度96%-99%rhPA.与阿替普酶对照品相比,圆二色谱分析显示,该纯化产物与阿替普酶有相似的二级结构;FAPA测定纯化产物rhPA的体外溶栓比活性,其值高达约214倍,远远高于阿替普酶溶栓药.
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