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[博士论文] 姜天宇
药物化学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:生物发光作为广泛存在于自然界的一种现象,是萤光素酶催化萤光素,从而将化学能转变为光能的过程,其本质是特殊的化学发光。生物发光与荧光的不同之处,在于不需要外部激发光源,故而不存在机体对外界光的吸收,所以在能量转换过程中的损失几乎等同为零。科学家们对于如何发展生物发光相关技术作出了大量的研究。目前有三类主要的生物发光系统被应用于科学领域,分别是腔肠素类生物发光体系、细菌生物发光体系和萤火虫生物发光体系,科学家们对其相应的萤光素酶和萤光素的研究都较为透彻。腔肠素-海肾萤光素酶生物发光系统是目前已知的必须成分最少的生物发光系统,其机理为海肾萤光素酶氧化腔肠素并释放出波峰在480nm左右的光。而细菌的生物发光是细菌萤光素酶在还原型黄素的辅助下,氧化长链饱和脂肪醛,进而释放出波峰470nm左右的光。本课题选定了腔肠素-海肾萤光素酶生物发光系统和细菌生物发光系统,从小分子底物的结构人手,通过设计、合成新型底物或者分子探针的方法对生物发光体系进行优化以及拓展应用。在腔肠素-海肾萤光素酶系统中,基于腔肠素类似物DeepBlueC,着重修饰其对于生物发光性质有着重要影响的分子骨架咪唑并[1,2-a]吡嗪的C-6位置,从而设计、合成了B、A和T三个系列的新型腔肠素类似物。B系列的结构特点是在骨架的C-6位引入不同的取代苯基或芳香杂环,A系列的结构特点是在C-6引入炔键,T系列的结构特点是在C-6位引入三氮唑基团。对化合物进行了海肾萤光素酶的酶活水平、稳定表达海肾萤光素酶的ES-2细胞水平,和稳定表达海肾萤光素酶的ES-2细胞的裸鼠移植瘤动物模型的生物学评价,结果显示大部分化合物都具备较好的生物发光性质。就整体系列而言,B系列的生物发光特性要优于A系列和T系列,其中部分化合物如B2、B5、B9和B12,在与海肾萤光素酶作用时,相对DeepBlueC,都具有较强的生物发光强度、较长的持续时间、生物发光光谱红移等特点,这些化合物在细胞水平上比DeepBlueC的生物发光特性更优,尤其B2在活体动物体内的生物发光成像测试中的表现也非常突出,强度和持续时间均在腔肠素(CTZ)之上,这使得其具有商品化潜力,有望替代现行的腔肠素作为腔肠素类生物发光系统的底物。在与海肾萤光素酶作用时,A系列化合物和T系列化合物的生物发光强度,相对DeepBlueC没有大幅度的提升。不过,整个A系列化合物的生物发光光谱相较DeepBlueC而言,都有不同程度的红移,A4和A6两个化合物在细胞水平上,在生物发光强度和持续性上都比DeepBlueC更具优势。整个T系列化合物虽然对海肾萤光素酶有响应,但是生物发光特性欠佳,并不是很适合成为海肾萤光素酶的底物。由于腔肠素是一种通用型底物分子,Gaussia萤光素酶/腔肠素也是生物发光成像技术中常见的组合,因此也尝试测试了B、A、T三个系列对于Gaussia萤光素酶的活性。得到的结果显示,B系列的活性相对较好,B2仍然是在发光强度、持续时间、动力学特性方面表现最优的化合物,发光强度上是DeepBlueC的三十多倍,但是远远不及腔肠素。A、T两个系列对于Gaussia几乎没有响应。整体而言,该三个系列的化合物对于Gaussia萤光素酶的响应较差。
  从构效关系的角度来看这三个系列化合物对于海肾萤光素酶的响应,在C-6位保留取代苯基或者是和苯基大小适宜的基团如呋喃基和噻吩基,引入极性较大的基团比如氨基是有益于保持生物发光特性的,因此整个B系列的生物发光活性强于A、T两个系列,吸电子基团的引入,比如说C-6的苯基对位引入硝基,导致化合物的生物发光活性减弱甚至消失。此外刚性较强的基团引入,比如在C-6位引入苯并呋喃基,也使得化合物的生物发光活性较低;三唑环虽然是苯环的电子等排体,在T系列中替代苯环引入在C-6位,但是实验结果证明三唑环的引入反而使得生物发光的活性下降;而在A系列中,由于炔键的引入使得整体分子的刚性增大,可能也影响化合物与萤光素酶的结合,使得A系列化合物的生物发光活性一般。
  针对细菌生物发光系统,利用“Caged”策略,设计开发了首个基于细菌生物发光机理的汞离子探针。该探针利用了汞可以水解二硫缩醛的反应机理和细菌生物发光系统的底物是长链脂肪醛这一特征设计得到。细菌生物发光的底物,葵醛分子中的的醛基是和萤光素酶作用的关键基团。当醛基与二硫醇发生化学反应成为二硫缩醛,这种缩醛状态的分子无法被细菌萤光素酶所识别,便无法产生生物发光。而汞离子具有催化脱除保护基的作用,使得醛基得以暴露,进而被萤光素酶识别,从而产生生物发光。利用生物发光成像技术,该探针可以实现在体外环境对汞离子浓度的定量分析和在体内环境检测汞离子的存在。但是该探针有一些缺点有待改进,如识别汞离子的线性范围有待扩大等。
  由于关于细菌生物发光体系的底物研究并不多,常用的底物多年来仍旧是天然的长链脂肪醛如葵醛,因此针对细菌生物发光体系设计了一系列新型的底物,用以扩大细菌生物发光底物的范围和选择。新底物的骨架由两部分构成,具有荧光性质的荧光团和可被细菌荧光素酶识别的长链醛结构。此类化合物的骨架中具有的荧光团结构使得这些新型化合物具有光学性质和荧光特征。这些选定荧光团的激发波长均在450-470nm左右,与天然底物的细菌生物发光的发射波长相当,而荧光团的发射波长均在510-550nm左右,那么这些化合物极有可能在与细菌萤光素酶作用之后,出现生物发光红移现象,此现象被称为类生物发光共振能量转移(BRET)效应。在评价过这些化合物的生物发光强度、发光光谱、动力学参数、相对量子产率、动物水平成像等方面的考察评价,发现其中的5a,5b,9a和9b具有生物发光特性,可以作为细菌生物发光的底物,其中,表现最佳的是5b。新型化合物相对葵醛,具有更大的极性和更好的水溶性,这些性质在产生生物发光时是有利的。化合物5a和5b相对化合物9a和9b,能诱发更强的生物发光以及良好的生物发光动力学特性。简要分析构效关系,1,8-萘二酰亚胺官能团的引入比2,1,3-苯并呋咱官能团更有优势。化合物5b相比5a,9b相比9a的生物发光性质更优。这说明,12个碳链长度的分子会更加适合与细菌萤光素酶作用。所有的新型化合物的生物发光衰减程度要比葵醛慢,这是新型化合物具有优势的一点。在动物水平的生物发光成像中,化合物5a和5b的表现接近天然底物葵醛。所有化合物均较葵醛,产生了光谱红移。通过生物发光光谱测定和GFP/OPEN比例的计算来验证新化合物的光谱红移,尽管光谱红移并不明显,但这也是首次运用新理念,开发拓展细菌生物发光底物的范围的一次尝试。
  综上所述,针对两类生物发光系统,从小分子的角度设计新型底物来优化生物发光系统,使得新型底物、海肾萤光素酶组合而成的生物发光系统的发光更强、持续时间更长、发射波长红移等,这些都是有助于生物发光系统更广泛应用的特点。而利用细菌生物发光而设计的汞离子探针是第一个生物发光类的汞离子探针,该探针对于如何用生物发光技术来检测汞离子具有重大意义。希望可以在这首个生物发光汞离子探针的基础上,进一步的优化、设计更有实用价值的重金属离子探针,可以更好的检测环境中和生物体内的重金属离子,实现实时监测重金属离子所造成的生物机体损伤成像等。细菌生物发光体系的新型底物的开发,填补了细菌生物发光系统除天然底物外无其他底物应用的空白。上述工作都为后续对于生物发光系统的优化研究奠定了一定的基础。
[专利] 发明专利 CN201610367854.2
山东大学 2016-09-28
摘要:本发明公开了一种腔肠素类似物及其制备方法与应用,具有结构通式(I),式中,R1,R2,R3均为不同的取代基。该类化合物作为生物发光底物的应用,能利用生物发光检测腔肠素萤光素酶的存在和数量(包括酶水平、细胞水平和动物水平),检测萤光素酶在体外,细胞和体内分布成像的应用;能够在萤光素酶的存在下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、动物水平的药理作用和毒性作用。
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