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[硕士论文] 周跃飞
生物化学与分子生物学 西北大学 2009(学位年度)
摘要:1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸酯(DXP)被认为是三条主要代谢途径的中间体,即细菌中硫胺素焦磷酸(维生素B1,ThPP)的生物合成过程、磷酸吡哆醇(维生素B6)的生物合成过程以及细菌和高等植物中通过MEP途径合成萜类化合物的过程。DXS酶是DXP合成酶,它是一个ThPP依赖性酶。在MgCl2存在下,它催化D—甘油醛-3—磷酸(D—GAP)和丙酮酸(Py)缩合生成DXP。同时,DXP又是1—脱氧—D—木酮糖5-磷酸酯还原酶(DXR)的底物,而DXR是萜类化合物生物合成的MEP途径中一个重要的限速酶,它催化DXP异构化为具有分支结构的MEP,是抗菌药物筛选的潜在靶分子。为了研究DXR的催化机理和寻找DXR酶的抑制剂,需要通过分子生物学手段制备较高活性的DXS酶,以及以该酶为工具合成不同位点氘标记的DXP。 本研究以构建好的pFMH30质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物以SDS—PAGE电泳分析。SDS—PAGE分析出现一条约66 kDa的条带,与预期融合蛋白的分子量相符。最后经过大量诱导该重组蛋白并纯化,得到目的蛋白DXS的浓度为11.8 mg/ml,纯度在90%以上。反相离子对HPLC鉴定DXS酶的活性,结果表明该酶有较高活性,可以用于后续氘标记的DXP的合成。 DXP是萜类化合物生物合成的MEP途径中的关键中间体,它由DXS酶催化D—GAP与Py缩合而成,或者通过TIM将磷酸二羟丙酮(DHAP)异构化为D—GAP然后与Py反应生成。通过一系列实验,优化了DXP的酶法合成条件。D—GAP是DXP合成中重要的原料,我们以D—果糖-6-磷酸为底物,经过四乙酸铅氧化生成D—GAP。合成D—GAP的产率约为60%,纯度在80%以上。为了合成不同位点氘标记的DXP,本研究在重水介质中,通过酶法或化学法对D—GAP、DHAP或Py分别进行氘标记,并在此基础上成功制备了[3,4-2H2]DXP、[4-2H]DXP、[3-2H]DXP和[1-2H3]DXP。产率和纯度都优于目前报道的以化学法进行的合成。
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