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摘要:目的 制备和鉴定抗Hsp83蛋白的多克隆抗体.方法 利用PCR技术从果蝇cDNA中获得hsp83基因片段,构建重组质粒;将其转化到BL21(DE3)菌株中诱导蛋白表达,利用Ni-NTA亲和法纯化重组蛋白;再将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体;利用免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光染色法检测多克隆抗体的特异性.结果 构建的pET28a-hsp83质粒在大肠杆菌中成功表达了Hsp83融合蛋白,蛋白纯化后作为抗原免疫小鼠,获得了抗Hsp83的多克隆抗体.免疫印迹法和免疫荧光染色法检测显示,抗果蝇Hsp83多克隆抗体具有较高的特异性,并能检测出内源性Hsp83蛋白.果蝇卵巢免疫荧光染色显示,Hsp83蛋白定位在卵巢细胞的细胞质中.结论 成功制备了小鼠抗Hsp83蛋白的特异性抗体,此工作为深入研究Hsp83蛋白的功能奠定了基础....
[专利] 发明专利 CN201811417387.5
安徽师范大学 2019-02-15
摘要:本发明公开了一种果蝇卵巢高表达转基因载体的构建方法,涉及生物基因工程技术领域,本发明使用一定长度的连接区(linker)将Gal4/UAS系统合二为一,并用VP16增强Gal4活性,以GFP蛋白质作为标签构建出一种在果蝇生殖系细胞中一步高表达的载体,该载体的NosP启动子两端有单一酶切位点,能够被替换,可以用来探究其它启动子的有效长度及表达模式,或者控制GFP的表达与否;在GFP序列的两端也有单一酶切位点,可被换成目的基因的编码区,进行组织特异性高表达靶蛋白;该载体具有直接、高效和灵活等特色,能够为广大科研工作者带来诸多便利。
[硕士论文] 周利娟
细胞生物学 安徽师范大学 2018(学位年度)
摘要:组织器官的内稳态是生物机体正常运行的基本保障,成体干细胞(adult stem cells,ASCs)是一类具有自我更新和潜在分化能力的细胞,自我更新与分化之间的动态平衡直接影响有机体内稳态的维持。研究表明,来自干细胞的内源因子以及干细胞周围的微环境分泌的外源因子都可以调节这种平衡。生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)是ASCs的一种类型,它在生殖细胞发生及种族绵延等生命过程中承担重要功能。果蝇(Drosophila melanogaster)作为一种重要的模式生物,其卵巢为生殖干细胞调控机制的研究提供了优秀的模型。周期蛋白(cyclin)作为调节因子,可以激活周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性,从而调节细胞周期的进程。研究显示,cycB3(cyclin B3)基因对雌性果蝇的育性是必需的,而且能够影响胚胎期细胞有丝分裂的进程等。我们的早期研究发现,与野生型果蝇(Oregon)相比,cycB3基因突变的果蝇卵巢GSC的数量有减少的趋势。由此,我们设计实验,借助免疫组织化学、转基因显微注射及有丝分裂重组等技术,研究了cycB3基因调控果蝇卵巢GSC的命运暨影响包囊母细胞(cystoblast,CB)的分化的初步机制,本研究成果将对干细胞和生殖生物学的调控领域作出贡献。
  首先,本研究通过免疫组化特异性标记GSCs,统计并分析了五组cycB3突变类型(cycB32/cycB32、cycB32/cycB3L6540、ycB32/cycB3EY08012、ycB3L6540/cycB3EY08012、cycB32/Df)羽化后不同天数每个原卵区内GSC的数量。结果显示:野生型果蝇原卵区通常包含2-3个GSC,并且随时间推移无明显变化。而五组cycB3基因突变果蝇正常原卵区的比例从1天的89.1%、86.6%、94.3%、80.8%和85.0%降到14天的22.6%、28.2%、27.6%、18.4%和20.4%。其中,cycB32/cycB32组的表型变化最明显,约74.6%的原卵区发生GSC数量减少现象,表明cycB3基因突变严重影响了GSCs的维持。
  然后,选取其中三组和Oregon进行rnRNA相对量检测,QPCR(Realtime Quantitative PCR)的分析结果显示:和对照组相比,突变体组cycB3基因的转录水平极显著下降。此结果表明cycB3基因突变导致了cycB3基因的转录严重不足。通过GFP报告系统,对CycB3-GFP融合蛋白的定位分析表明:cycB3仅在生殖系细胞核中表达,暗示了cycB3基因发挥着内源性的调控GSC维持的功能。基于此,我们利用镶嵌体分析技术标记cycB3基因突变的GSC,确证cycB3基因内源性调控GSC命运。结果显示,与对照组相比,实验组的标记GSC随时间的推移逐渐丢失,充分支持cycB3基因是GSC命运调控的内源性因子这一推论。
  为进一步确证cycB3基因的功能,我们利用转基因手段在cycB3突变的背景下补充cycB3基因,进行了一系列的挽救试验。本试验选择羽化后第14天果蝇的正常原卵区作为统计分析的对象。结果显示,广谱挽救组cycB3P-cycB3和两组内源挽救组(nosP-cycB3;cycB32/cycB32和UASp-cycB3/nosP-gvp;cycB32/cycB32)的比例分别恢复至正常水平,表明仅内源补充cycB3即可挽救突变表型。而外源性挽救组(C587-gal4;UASp-cycB3;cycB32/cycB32)果蝇的正常原卵区比例与突变体无明显差异,表明挽救失败。综合上述结果,充分表明cycB3内源性的发挥着调控GSC命运的功能。
  cycB3缺失导致GSC数量减少,为探讨GSC的去向问题。首先,我们采用TUNEL技术检测了cycB3突变GSC的凋亡情况。结果显示,突变GSC未出现明显的凋亡(与对照组相比),表明cycB3突变没有导致GSC凋亡。其次,分析并统计了GSC中细胞器——“spectrosome”的形态学,对cycB3是否影响GSC有丝分裂的各时相进行了研究。结果显示,突变体和野生型果蝇之间无明显分裂时相上的差异,表明cycB3突变没有影响GSC有丝分裂的进程。然后,运用EdU细胞增殖(脱氧尿嘧啶标记DNA)法检测基因突变对细胞增殖活性的影响。结果表明:GSC增殖并不受cycB3基因突变的影响。总之,上述结果显示cycB3突变不影响GSC的分裂和增殖,也没有促使GSC走向凋亡,而是促使GSC提前发生了分化。
  为了揭示cycB3与BMP信号通路的关系,研究了cycB3与该信号通路的重要组分bam的上下位关系。首先,利用bam-GFP报告基因系统结合免疫荧光染色技术检测了cycB3突变背景下bam基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;bam-GFP)中bam的表达模式与对照组(bam-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不是位于bam的上游发挥作用。其次,分析比较了bam突变和cycB3&bam双突变条件下GSC/CB的数量变化。结果发现:bam单突变和cycB3&bam双突变果蝇羽化后第10天的卵巢原卵区中均充满生殖干细胞样细胞(GSC-like cells),无明显差异,表明bam缺失抑制了cycB3突变导致的GSC丢失表型。综合上述结果,我们提出假说,cycB3可能通过依赖于bam的方式调控GSC的维持。
  此外,我们还研究了cycB3与GSC内源性调控因子Dad的遗传互作关系。Dad基因属于BMP下游的靶基因,其表达受控于BMP信号;同时,Dad蛋白又能反作用于BMP受体,降低BMP信号的效应。利用Dad-GFP报告基因系统结合免疫组化技术检测了cycB3突变背景下Dad基因的表达模式。结果显示:实验组(cycB32/cycB32;Dad-GFP)中Dad的表达模式与对照组(Dad-GFP)无明显差异,该结果表明cycB3基因不参与Dad介导的BMP信号通路。
  前面工作表明cycB3缺失导致了GSC数量减少,那么cycB3缺失是否影响包囊母细胞(CB)向卵母细胞的分化呢?研究表明卵母细胞中Orb基因的表达情况可以作为卵母细胞正常分化的标志。鉴于此背景,本课题利用Orb抗体检测了卵母细胞内Orb蛋白的表达。结果显示:与对照组相比,cycB3突变的卵母细胞中Orb表达无明显下调,表明CB到卵母细胞的过渡不受cycB3基因突变的影响。
  既然cycB3缺失导致了GSC提前分化,那么,过表达cycB3基因是否会促进GSC的增殖和抑制CB的分化?结合卵巢中bam的表达模式,我们分别统计了卵巢原卵区中GSC和CB两类细胞的数量。结果表明过表达cycB3没有促进卵巢GSC的增殖,但明显延滞了CB的分化。
  综合上述研究结果,cycB3基因内源性调节果蝇卵巢生殖干细胞的命运,cycB3基因突变导致GSC的自我更新和分化失衡,促使GSC提前走向分化。此外,cycB3依赖“BMP/Dpp-bam”信号通路发挥功能,在GSC中,cycB3基因不参与bam基因的沉默,通过抑制GSC的分化使其维持干性;在CB中,cycB3基因位于bam的上游,通过抑制Bam蛋白的活性而抑制CB的分化。
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