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摘要:目的:构建含有小鼠Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein 10)基因的重组腺病毒表达载体。方法:设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和Sal Ι酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18 T载体。测序后,用Sal Ι和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到 pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察 GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果:用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论:小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。...
[博士论文] 周作琼
遗传学 湖南师范大学 2017(学位年度)
摘要:一、hprg1b基因的功能研究及其干细胞系建立
  脊椎动物hprg1基因编码两种同源的蛋白异构体,分别是Hprg1a和Hprg1b。在酵母中,Hprg1b蛋白的同源蛋白作为一种E3泛素连接酶组分而参与调控糖代谢过程。早前在人类基因组范围内大规模筛选E3泛素连接酶的研究中,发现人的Hprg1b蛋白可通过其R型锌指结构域与E2泛素结合酶相互作用,形成一种新的泛素酶蛋白复合体。最近,Hprg1蛋白在爪蟾中的研究表明,蛙的Hprg1可能通过其E3泛素连接酶的作用而调控胚胎的头部发育。另外,含有hprg1b基因的染色体片段缺失的人类胚胎,出现严重的畸形发育。但是,目前hprg1b基因在胚胎发育中的具体作用仍不清楚。
  斑马鱼基因组只编码一种Hprg1蛋白,即Hprg1b蛋白。本文将斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列,同人、小鼠、龟、鸡和爪蟾的Hprg1a和Hprg1b的蛋白质序列进行比对分析,发现斑马鱼Hprg1b的蛋白质序列与这些物种中的Hprg1蛋白质序列相似度超过了68%。而且,本文分析了人、小鼠、龟、鸡、爪蟾和斑马鱼的hprg1a和hprg1b的基因结构,发现这些基因间具有非常保守的剪切位点和基因结构。在进化过程中,hprg1基因高度保守的蛋白序列和基因结构,说明了该基因的功能是高度保守的。另外,我们进一步研究了人、小鼠和斑马鱼hprg1b基因及其附近基因的染色体同线性关系,发现hprg1b基因及其附近基因在人、小鼠和斑马鱼中具有染色体同线性,说明了斑马鱼hprg1b基因是人和小鼠hprg1b基因的直系同源基因。因此,本文在斑马鱼中研究hprg1b基因的作用,有利于揭示该基因在高等脊椎动物中的作用。
  通过ddPCR技术,精确定量了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达。实验结果显示,在斑马鱼的胚胎发育过程中,hprg1b基因具有很强的母源性表达,并且在斑马鱼胚胎发育的整个过程中,hprg1b基因一直持续高表达。同时,本文利用原位杂交技术分析了hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,发现在斑马鱼的胚胎发育中,hprg1b基因表达的区域与斑马鱼脑部和心脏的形态建成区域完全重合。hprg1b基因在斑马鱼胚胎中的表达模式,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼的胚胎发育,特别是脑和心脏的发育。
  为了研究hprg1b基因在斑马鱼胚胎发育中的作用,我们设计了斑马鱼hprg1b基因的翻译阻断型morpholino。并且通过蛋白质印迹实验,发现注射该morpholino的斑马鱼,Hprg1b蛋白的表达量明显减少。在合子期阻断hprg1b基因的表达后,发现斑马鱼出现大量死亡,致死率高达80%。并且存活下来的斑马鱼大部分出现脑部和心脏发育异常等畸形,畸形率高达93%。在观察hprg1b基因敲低斑马鱼的脑部发育中,发现在24 hpf,hprg1b基因敲低斑马鱼的前脑区域极度变小;中脑、后脑原基和后脑区域的结构不明显。hprg1b基因敲低斑马鱼发育到72 hpf,与对照组斑马鱼相比,其头部畸形愈加明显,整个头部区域变小,无明显的前脑、中脑和后脑的形态构造。同时,仔细分析hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏在胚胎发育过程中出现的畸形,发现其心脏畸形主要表现为心脏环化异常、心房和心室腔室变少。而且,统计72 hpf的斑马鱼离体心脏的细胞数量发现与对照组斑马鱼比较,hprg1b基因敲低斑马鱼的心脏细胞明显减少。
  并且,通过原位杂交技术和ddPCR技术分析了早期心肌细胞分化标志基因cmlc2在心盘、心管、心房和心室等结构中的表达。与对照组斑马鱼相比,hprg1b基因敲低斑马鱼的cmlc2表达量和表达区域明显变小,说明了hprg1b基因可以通过调控心肌细胞的发育,来影响斑马鱼胚胎的心脏发育。其次,通过原位杂交技术检测了房室通道结构发育重要调控因子bmp4在72 hpf斑马鱼心房和心室交接处中的表达。实验结果显示,hprg1b基因敲低斑马鱼的bmp4的表达量明显低于正常水平,说明了hprg1b基因可能影响斑马鱼房室通道内部结构的发育。同样,在72 hpf hprg1b基因敲低斑马鱼心脏中,心内膜标记因子has2表达下调,说明hprg1b基因敲低斑马鱼房室心内膜发育异常。另外,本文通过免疫组化分析发现了心肌肌球蛋白重链在hprg1b基因敲低斑马鱼的心肌细胞中表达降低,而且其排列异常,提示hprg1b基因可能影响斑马鱼心脏收缩功能。
  针对hprg1b基因敲低斑马鱼出现大规模死亡和畸形的现象,本文通过ddPCR技术,检测了斑马鱼胚胎发育重要的调控因子的表达。实验结果表明,hprg1b基因敲低斑马鱼的外胚层标记因子(fgf8和otx2),中胚层标记因子(gata4,gata5,和nt1),和内胚层标记因子(sox17)等基因的表达量明显低于对照组斑马鱼,提示hprg1b基因可能通过调控斑马鱼胚胎基因的表达,来影响斑马鱼的胚胎发育。
  另外,本文构建了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系。该胚胎干细胞系具有繁殖快、转染效率高、表达多种核心多能基因的特点。随后,将hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞移植进入了野生型斑马鱼中,追踪了Hprg1b阳性细胞的发育命运。在嵌合体斑马鱼发育到24 hpf,观察到在前脑、中脑、后脑原基、后脑和心管中,具有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞出现。在48 hpf嵌合体斑马鱼中,我们发现脑部、心室和心房中也均有外源性的hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞。hpr1gb-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞的细胞移植实验,说明在斑马鱼的胚胎发育过程中Hprg1b阳性细胞可以发育成为脑和心脏细胞。
  因此,本文利用斑马鱼模型研究hprg1b基因的功能,首次证明了hprg1b基因在脑部和心脏的发育中起作用;并建立了hprg1b-egfp转基因斑马鱼胚胎干细胞系,为hprg1b基因的深入研究和揭示早期心脏发育的分子机制提供了很好的细胞模型。
  二、斑马鱼磁力蛋白和隐花色素同源基因鉴定
  许多动物可以通过磁场来进行定位或导航。最近在果蝇中研究发现,磁受体蛋白(MagR)和隐花色素(Cry)形成的复合体是磁力感应的分子基础。MagR和Cry蛋白广泛表达于各种动物中,但是它们在不同动物中的功能是否保守仍不清楚。为了探究MagR和Cry在低等脊椎动物中的功能,我们分别鉴定并分析了它们在斑马鱼中对应的同源基因的表达情况。人基因组含有一个MAGR基因和2个CRY基因。斑马鱼也只有一个magr基因,却含有7个cry基因。通过蛋白序列比对、基因结构和染色体同线性分析,我们发现magr基因在进化过程中高度保守,并且斑马鱼magr基因是人MAGR基因的直系同源基因。并且,斑马鱼有4个cry1基因(cry1aa,ry1ab,ry1ba,cry1bb)是人类CRY1基因的同源基因,1个人CRY2直系同源的基因,以及2个斑马鱼cry相似基因(cry4和cry5)。RT-PCR分析发现,在斑马鱼胚胎和成体组织中magr基因泛表达,而所有cry基因只在脑和眼睛中显著表达;在斑马鱼胚胎发育中斑马鱼magr基因和除了cry1aa外的其余cry基因都具有母源性表达。此外,我们利用翻译阻断型morpholino敲低magr基因的表达,斑马鱼没有出现明显的死亡变化和发育异常,并且胚胎发育调控因子fgf8、otx2、 gata4、gata5、has2、nt1和sa114的表达也无明显变化。因此,我们的结果表明,在斑马鱼基因组中magr基因和cry2基因为单拷贝基因,cry1为多拷贝基因。而magr基因在斑马鱼器官形成中未见明显作用,提示可能需要建立magr敲除品系以进一步探究其功能。
  三、tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析
  最近几年,二代测序技术迅猛发展,极大的缩减了测序费用和测序时间,使基因组转录本测序(RNAseq)分析成为研究信号通路和靶基因筛选的最佳选择。本文将tmp3基因敲除斑马鱼囊胚期的胚胎进行了转录组测序。利用tophat软件将测序序列比对到斑马鱼参考基因组上,再通过htseq-count软件分析映射结果来鉴别外显子之间的剪接点,共得到了24102个基因的表达数据。在R语言中通过DESeq2软件包,得到了tmp3基因敲除斑马鱼和野生型斑马鱼差异表达的2194个基因,其中表达上调基因为1231个,表达下调基因为963个。然后,使用goseq软件包对差异表达基因进行了基因本体(GO)富集分析。对表达下调基因的GO富集类型分析后,我们发现下调基因的GO富集类型主要与斑马鱼中胚层发育和细胞增殖相关。结合tmp3基因敲除斑马鱼心脏异常的表型,我们从表达下调的基因中挑选出与中胚层发育相关的基因dharma、foxa2、 lefty1、k1f2a、mespaa、noto、t111、ape1a、tbx16和tdgf1,以及与细胞增殖相关的基因rrm2、gmnn、po1d1、map2k2b、ccnk、ccn11b、cdca8、aurka和cdk4,作为tmp3的候选靶基因。总之,本文关于tmp3基因敲除斑马鱼RNAseq分析,为tmp3基因的深入研究提供了思路。
摘要:设计小鼠 Txt5基因的特异性引物,将小鼠 cDNA 作为模板,用 PCR 扩增出 mTxt5编码区,并加入 HA标签序列.将这一片段插入 pMD -18T 载体,再亚克隆至 pAdtrack - cmv 穿梭载体上.线性化后,转化 BJ5183感受态细胞,在 BJ5183中发生同源重组获得 pAd - Txt5质粒.pAd - Txt5线性化后转染293A 细胞,包装得到含 Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过 RT - PCR 和免疫印迹法检测 HA 标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠 Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达....
摘要:调控骨骼肌发育的分子机制尚不完全明了.有证据显示LIM-only蛋白FHL1与骨骼肌的生长以及人体骨骼肌病有关联,但FHL1在骨骼肌发育中的作用还有待阐明.本文以斑马鱼为模型研究了FHL1在斑马鱼中的一个同源基因fhl1A的表达模式及其在骨骼肌发育中的功能.胚胎整体原位杂交结果显示,3-体节时fhl1A在体节处不表达;10-体节期fhl1A在体节强表达,而20-体节期fhl1A仍在体节表达,但表达水平降低.这种变化的表达模式提示fhl1A可能参与调控骨骼肌的发育.敲低fhl1A导致骨骼肌的形态发生异常.分别用F59和4D9抗体进行免疫荧光分析,结果显示敲低fhl1A导致24hpf胚胎的肌球蛋白明显减少,但Engrailed蛋白没有明显变化,表明fhl1A可影响慢肌的发育但不影响慢肌前体细胞的发育。另外,RT-PCR结果显示,敲低fhl1A的24hpf胚胎中pax7a、pax7b以及sk MLCK的m RNA水平显著下降。同时,pax7抗体标记的卫星细胞数目明显减少。RA处理导致10-体节期胚胎的fhl1a表达明显上调,而RA信号通路的抑制剂DEAB的处理则显著抑制了fhl1a的表达,提示内源性fhl1a的表达受RA信号通路的调节。总之,这些实验结果表明fhl1A在体内对于调节骨骼肌发生和卫星细胞的数目是必需的。
[硕士论文] 周作琼
遗传学 湖南师范大学 2014(学位年度)
摘要:HET1是Db(l)蛋白结构域家族的一类鸟苷酸交换因子,它能够调节Rho家族的G蛋白与GDP或GTP的结合状态。当G蛋白与GTP连接,其GTPase活性激活,其下游效应蛋白被激活,传递细胞信号;当G蛋白与GDP结合时,其GTPase失活,则不发挥作用。HET1对Rac1、Cdc42和RhoA结合GTP状态和GDP结合状态之间的转换,具有重要调控作用。HET1在脑、心脏、肌肉等兴奋组织中广泛并高表达,它能通过对小G蛋白的激活调控,进而影响细胞形状、分裂、迁移,细胞极性和细胞粘连。以往的研究表明,肌肉损伤后HET1表达上调,并且利用腺病毒外源性过表达HET1能加快肌肉损伤的修复,并且Rac1,Cdc42和RhoA GTPase激活。在体外C2C12细胞系中,HET1能促使C2C12向肌细胞分化,并抑制其向脂肪细胞分化。尽管如此,由于体内基因敲除小鼠模型的缺乏,Het1在体内肌肉再生和分化中的功能仍不清楚,我们首次建立了Het1fl/fl小鼠,使之与EII-Cre转基因小鼠杂交,得到HET1全敲小鼠,PCR与Southern的结果都显示,HET1全敲小鼠中基因片段的剔除。但是全敲小鼠与野生型小鼠的生活状况无明显差异,而且心、肌肉、胃和肠的组织切片对比,观察发现两者无明显区别。我们利用注射心脏毒素(CTX)成功诱导了一个肌肉损伤和修复的模型。我们向小鼠骨骼肌注射50μl的10μg/ml的心脏毒,通过检测c-myc、MyoD和myogenin因子发现,在注射CTX5天后,肌肉卫星细胞增殖和向肌细胞分化达到顶峰。而且我们通过对全敲小鼠和野生型小鼠分别注射心脏毒素5天,10天后,取肌肉损伤部位进行组织切片对比,观察发现HET1全基因敲除鼠,肌肉损伤恢复状况较野生型小鼠明显延迟。我们的结果首次在体内证明,HET1在调节肌肉损伤修复中的重要作用。
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