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摘要:异育银鲫作为我国重要的淡水经济鱼类,其鳃出血病为主要病害,并造成重大经济损失,该病病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2).目前,研究主要在该病的检测和病理方面,对于免疫学检测方面研究较少.本研究根据CyHV-2 ORF72基因序列设计了1对特异性引物,利用患病异育银鲫肾脏DNA作为模板,通过PCR扩增得到CyHV-2 ORF72基因全长,该基因序列全长为1113 bp,可编码370个氨基酸的蛋白.该基因与pET-28a表达载体连接构建重组原核表达载体pET-ORF72转入大肠杆菌中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45 ku的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致.将纯化的重组蛋白皮下多点注射免疫新西兰大耳兔制备了ORF72的多克隆抗体,经Western Blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好反应,特异性较好,本结果可为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定基础....
摘要:异育银鲫病毒性鳃出血是近年来严重威胁异育银鲫养殖业发展的重大病害,自从2012年春季在江苏暴发以来,已经造成鲫鱼养殖重大病害损失,研究已经证明,引起该病的主要病原为鲤科疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2),由于是新发现的病毒性病害,目前尚未筛选出有效的治疗药物,有针对性的疫苗也尚未面世. 面对日趋严重的病害及广大养殖户对该病防控技术的需求,笔者在该病病原学研究基础上,并结合近4年的流行病学调查,提出如下预防与控制技术,供养殖生产者参考....
摘要:鲫属鱼类分类学属于鲤形目,鲤亚目,鲤科,鲤亚科,鲫属。本属鱼类在我国共有二个种和一个亚种,分别为黑鲫、鲫鱼和银鲫亚种,但我国鲫鱼养殖品种众多,通过农业部全国水产原种和良种委员会审(认)定的鲫鱼良种和观赏类鲫鱼主要有彭泽鲫、松浦银鲫、异育银鲫、湘云鲫、金鱼、红白长尾鲫、蓝花长尾鲫、黄金鲫。除鲫属观赏鱼外,鲫属鱼类(以下简称鲫鱼)一直是我国大宗淡水鱼类养殖重要品种,广泛分布于全国各地,据统计,2012年,全国鲫鱼养殖产量近245万吨,养殖总量位居我国淡水鱼品种第五位,其中长江流域的江苏、湖北、江西、安徽、湖南等省是全国鲫鱼最主要养殖区,鲫鱼产业对于全国大宗淡水渔业发展具有重要意义。...
摘要:异育银鲫病毒性鳃出血(俗称"大红鳃")是近年来严重威胁异育银鲫养殖业发展的重大病害,自从2012年春季在江苏暴发以来,已经造成鲫鱼养殖重大病害损失,研究已经证明,引起该病的主要病原为鲤科疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2),由于是新发现的病毒性病害,目前尚未筛选出有效的治疗药物,有针对性的疫苗也尚未面世....
摘要:自2008年以来,宝应县养殖的异育银鲫发生不同类型和不同程度的疱疹病毒病害,其中2011一2013年发病点明显增多、连片发病面积不断扩大,死亡率急剧升高、经济损失惨重,病害发生形势不容乐观,因此我们对2008-2013年病害开展了流行病学调查和研究,现将结果总结如下. 一、材料与方法 在全县范围内,根据设立的8个水产病害测报点上报病情信息,实地走访发病池塘开展调查,调查项目包括发病历史、发病季节、主要危害对象、发病症状.并进行病理学检测和分子生物学检测. 二、结果 1.流行病学调查 (1)发病历史.2008年11月,宝应县1个水产病害测报点首次报送异育银鲫“黑鳞症”病害,发病面积150亩,养殖池塘水质无异常,患黑鳞症状的鱼严重影响商品鱼的外观,未见明显死亡,但严重影响销售,至2009年春季,越冬后的患黑鳞症状的商品鱼出现小批量死亡,但病害流行范围较小.2010年陆宏达等报道的类疱疹样病毒引发的异育银鲫上皮瘤病,对照症状,初步诊断2008-2009年异育银鲫“黑鳞症”病害为类疱疹样病毒引发的上皮瘤病....
摘要:2011-2013年,江苏省局部地区发生新型异育银鲫鳃出血病,给养殖业造成较大经济损失。为查明病因,了解发病历史、发病季节、发病症状及危害对象,通过在江苏省宝应县开展水产流行病学调查,结合组织病理学、回归感染试验、分子生物学诊断等研究方法,证实异育银鲫鳃出血病病原为鲤科疱疹病毒-Ⅱ型,由于该病害会导致异育银鲫养殖重大损失,因此需要引起国内相关养殖业主、科研工作者更多关注。...
[期刊论文] 吴霆 华伯仙 顾伟 王文
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北大核心
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摘要:中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹(以下简称河蟹),河蟹颤抖病是对其养殖危害最大的重大流行病,自从1994年发现以来,每年都是各地的河蟹养殖最严重的疾病之一,尽管近年来河蟹颤抖病发生有减缓趋势,但局部地区仍有大面积暴发,死亡率仍可高达50%以上,给河蟹养殖造成巨大损失....
[期刊论文] 吴霆 王文
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北大核心
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摘要:颤抖病是对河蟹养殖危害最大的流行病,经过多年的系列研究,业已证实螺原体是引发河蟹颤抖病的主要病原之一,螺原体性颤抖病是河蟹颤抖病的主要类型....
[期刊论文] 吴霆 顾伟 王文
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北大核心 AJ CA CBST
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摘要:用水产常用清塘剂、杀菌驱虫药、消毒剂、中草药及自配药物克螺威1号(SI-1)对中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体进行体外药敏试验.结果表明,螺原体对生石灰、茶籽饼、敌杀死、硫酸铜、硫酸锌、次氯酸钙、三氯异氰脲酸、二氧化氯、溴氯海因、二溴海因、高锰酸钾、五倍子、黄连、黄柏及自配药物克螺威1号具有不同程度的敏感性.通过最小杀菌浓度(MBC)比较,螺原体对清塘剂茶籽饼、杀菌驱虫药硫酸铜、消毒剂次氯酸钙、中草药黄连、自配药物克螺威1号更为敏感,其中克螺威1号为最敏感药物,最小抑菌质量浓度(MIC)为0.16 mg/L,MBC为2.5 mg/L.对克螺威1号进行急性毒性试验和颤抖病治疗试验表明,克螺威1号的96 h LD50为1106.62 mg/kg,安全使用量为110.66 mg/kg.用其治疗人工诱发颤抖病的中华绒螯蟹,克螺威1号具有显著效果(P<0.05),随后在10个被确诊为螺原体引发中华绒螯蟹颤抖病的养殖场进行药物治疗试验,在6个养殖场治疗有效,而在其他4个养殖场治疗无效,治疗试验效果不一,用克螺威1号治疗中华绒螯蟹颤抖病具有较好的前景,但仍需进一步做大面积长期临床试验....
[期刊论文] 吴霆 毕可然 王文
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北大核心 AJ CA CBST
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摘要:提取人工分离、培养的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的基因组DNA,并进行梯度稀释作为PCR模板,根据GenBank已有螺原体16S rRNA基因序列设计出套式PCR外部引物,将螺原体特异性引物作为内部引物,利用套式PCR对梯度稀释的模板进行扩增,得到271 bp产物,对照已有的一步PCR检测法,检测灵敏度提高100倍,最小检测达15.5fg数量级螺原体DNA,从而建立更为灵敏的中华绒螯蟹颤抖病病原螺原体的检测方法....
[期刊论文] 吴霆 曹务华
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AJ CA
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摘要:1引言 淡水生态对于人类发展的重要性是不言而喻的,它不仅可提供食物、工农业及生活用水,而且还具商业、交通、休闲娱乐等诸多服务功能.更重要的是作为一种重要的生态系统类型,淡水生态系统还是生物圈物质循环的主要通道之一[1],很多营养盐及污染物在其中进行迁移和降解....
摘要:河蟹为杂食性动物,喜欢在水质清浅、水草茂盛的江河湖泊中栖息生长.河蟹池塘养殖,一般春季投放扣蟹,9月开始回捕,在几个月的养殖周期中,每个阶段都有不同的管理重点.高温期是河蟹病害高发期,本文将该时期的管理重点划分为底质改良、水质调控、水中生物群落的管理及其他日常管理4个方面,并以此为基础介绍了养殖过程中出现的常见问题和解决方法....
摘要:异育银鲫是我国重要的淡水养殖品种,但是鲤疱疹病毒Ⅱ型对其造成了重大经济损失,该病毒致死率几乎可以达到100%.为了能够有效预防和控制该病毒,需要建立一种高效灵敏的定量方法.为此,本实验室根据CyHV-16基因序列设计引物,利用SYBR Green法建立了异育银鲫中鲤疱疹病毒Ⅱ型Realtime PCR方法,可以定量鲫鱼体内疱疹病毒载量,绘制了标准曲线,根据各个组织中病毒的拷贝数分析出该病毒在不同组织中的表达分布,其中脾、肾组织中表达量较高,鳃、肝、肠、肌肉等组织中表达量较低.这些数据为预防和控制异育银鲫Ⅱ型疱疹病毒奠定了实验和研究基础....
[博士论文] 吴霆
生物学;水生生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:鲫鱼是我国最为常见的淡水养殖鱼类,广泛分布于全国各地,是我国大宗淡水鱼类养殖结构的重要组成品种。2012年,全国鲫鱼养殖产量近245万吨,居我国淡水鱼品种第五位,异育银鲫(C.auratus gibelio♀×Cyprinus carpio var.singuonensis♂)是近二十年来鲫鱼养殖推广最为广泛的品种,但自2012年以来,异育银鲫发生了一种严重的新型病害——鳃出血病,在主要养殖区广泛传播,给养殖生产造成巨大的经济损失。
  鳃出血病不同于鲫鱼的常规病害,它具有低水温发病、传染性强、发病迅速、致死率高、难以预防和控制等特征,更重要的是国内以前未有发病报道,发病原因不明,流行规律也不清楚,这严重威胁了异育银鲫养殖业发展。因此,迫切需要开展新型疫病的流行病学调查,查明发病规律;开展病原鉴定,查明病因;建立有效检测方法;同时阐明其致病机理,为下一步进行异育银鲫鲤出血病的防治奠定了基础。
  1.开展流行病学调查
  根据《江苏省水产养殖病害测报规范》,开展流行病学调查,得出鳃出血病的基本流行规律:(1)多发于春季和秋季,水温15~25℃是发病高峰期;(2)患病鱼鳃部出血明显,病鱼尾鳍、背鳍末端色素减退、明显发白,病鱼鳔上有明显出血性瘀斑;(3)具有明显传染性,主要危害一龄幼鱼与二龄成鱼;(4)病原具有较强的宿主专一性,不感染同一养殖环境内的其它淡水鱼类;(5)集中投喂方式引起更高的传染率。
  2.异育银鲫鳃出血病的组织与超微病理学研究及病原鉴定
  组织病理结果显示:病鱼鳃瓣处出现血细胞浸润,鳃小片融合,伴有上皮细胞坏死和脱落;鳃瓣内成团的吞噬细胞带有大小不一的胞浆空泡,显示具有弱嗜碱性;病鱼肾脏肾小球有局灶性坏死病变,毛细血管壁扩张;肾小球肥大细胞核固缩、碎裂,严重空泡化。患病鱼脾脏内血细胞和淋巴样细胞浸润,出现严重空泡化。许多脾脏细胞核染色质边缘化,有些出现核碎裂。患病鱼肝细胞核增大,有核内包涵体,细胞核肥大伴有核固缩,同时有严重的空泡化;肝内胆管显示有炎症,管壁细胞肿胀彼此融合,导致管壁粗糙和异常。患病鱼肠上皮细胞脱落,肠粘膜受损,结缔组织有增生。对病鱼的相应组织进行病理半定量评估,病理变化最显著的是肾脏,其次是鳃、脾脏和肝脏。超微病理观察发现,病鱼鳃、脾脏、肾脏有病毒感染,在细胞质内具包膜病毒粒子170-200nm。病毒在细胞质内有进行成熟加工过程,病毒粒子穿越高尔基网进入带有糖蛋白的囊泡,在囊泡内形成包膜病毒,通过细胞质衣壳的二次包裹,最终在细胞质中形成成熟病毒粒子。
  利用鲤科疱疹病毒聚合酶基因的特异性引物从病鱼鳃、肾脏和脾脏组织中PCR扩增出362bp的目的条带,测序后序列比对结果显示与金鱼造血器官坏死疱疹病毒(CyHV-2)具有99%相似性,病毒分子鉴定的结果为鲤科疱疹病毒Ⅱ型。
  利用柯赫氏法则开展病原验证,健康鱼人工回感后第3日开始出现死亡,濒死鱼具备自然发病鱼的鳃出血、尾鳍背鳍末端发白、鱼鳔上具出血性瘀斑等典型临床症状,至第5日,回感组鱼全部死亡。分子检测回感死鱼的鳃、肾、脾、肝等组织均为CyHV-2阳性,电镜检查肾、脾组织也观察到CyHV-2病毒颗粒,进而确证鲤科疱疹病毒Ⅱ型为异育银鲫鳃出血病的病原,与此前及此后相关报道一致。
  3.CyHV-2荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)检测方法的建立
  通过探针合成、荧光标记、原位杂交等过程,建立CyHV-2荧光原位杂交检测方法,结果表明:探针不与健康鱼组织结合,证明其具有特异性。在肾脏、脾脏、肝脏和鳃局部坏死病灶出现的荧光强度最大,这与HE染色的组织病理学分析结果一致。对于CyHV-2检测,荧光强度最大是在43℃。另外探针浓度在5ng/μL时即可以获得特异和足够的荧光,探针浓度过高(50ng/μL)导致荧光强度升高,但特异性降低。
  4.基于转录组和蛋白组学研究CyHV-2的致病机理
  为了进一步探究CyHV-2侵染异育银鲫的分子致病机制以及宿主相应的免疫机理,本章通过转录组测序和TMT(Tandem Mass Tag)标记定量蛋白质组学技术,筛选CyHV-2感染异育银鲫3天后出现典型症状时,头肾中具有差异表达的基因和蛋白,结果表明:通过转录组序列分析发现异育银鲫感染CyHV-2后,其头肾中有3090个显著上调基因,有3995个显著下调基因;而通过TMT蛋白组定量技术筛选得到197个蛋白表达显著上调,53个蛋白表达显著下调;转录组与蛋白质组联合分析结果表明,转录和蛋白表达都上调的有86个,转录和蛋白表达都下调的有42个。KEGG信号通路发现上调蛋白或基因主要富集在单纯疱疹病毒感染信号通路、RIG-I样信号通路、坏死性凋亡等免疫相关信号通路中。QPCR结果进一步显示这三条信号通路中的LGP2、RIG-I、MDA5、FAS、PKZ、PKR基因的转录水平在感染CyHV-2后的典型发病期显著上调,这与转录组和蛋白组的变化趋势一致。
  5.基于代谢组学研究CyHV-2对异育银鲫代谢的影响
  为了进一步探究CyHV-2侵染对异育银鲫代谢的影响,本章使用了基于LC-Q/TOF-MS分析平台的非靶向代谢组学方法,对异育银鲫感染CyHV-2的血清代谢组的变化进行了调查研究。通过代谢组数据一共鉴定到79种差异代谢物,其中几种碳水化合物(葡萄糖、甘露糖、核糖等)、脂肪酸(十五酸、花生四烯酸、棕榈酸、二十碳五烯酸、羟基二十碳四烯酸、亚油酸及其衍生物)、大部分的氨基酸及其衍生物浓度显著升高。同时鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷、VB2等物质显著下调。代谢通路分析结果显示患病鱼糖和氨基酸转运能力、tRNA及氨基酸合成能力增强。
[成果] 1500150033 江苏
S944.12 基础研究 [农业科学研究与试验发展, 渔业服务业] 公布年份:2014
成果简介:成果的创造性、先进性: ①河蟹"颤抖病"致病原的确定及新型病原螺原体的发现和命名,国际上首次证实螺原体是水生甲壳类的新型致病微生物,为水生动物病害研究开辟了一个新的研究领域; ②率先开展了河蟹螺原体基因组学和相关功能基因及非编码RNA的研究,初步揭示了螺原体的分子致病机理; ③明确了除河蟹外的其他水生甲壳动物(克氏原螯虾、罗氏沼虾及淡水养殖凡纳对虾、日本沼虾)的螺原体病原,建立了虾蟹螺原体疫病的防控关键技术(包括快速诊断试剂盒)并进行了示范和推广,效果显著.作用意义(直接经济效益和社会意义):该项目建立了集快速检测和综合防治为一体的水产螺原体疫病防控关键技术,在南京、宝应、高邮、句容、泗洪等地推广应用,成效显著,促进了虾蟹产业的可持续发展和农民的增产增收.由于虾蟹螺原体病原是首次发现,也是在中国本土分离的菌株,所以建立在此基础上的一系列相关成果和技术都具有中国自主知识产权,这些成果和技术的应用对提升中国水产病害的基础研究和应用研究具有推动作用.
摘要:异育银鲫疱疹病毒类病害是新型鱼类疾病,其中由鲤科疱疹病毒-Ⅱ型(CyHV-2)引起的疾病对于异育银鲫养殖具有极大危害,本文调查和研究了近年江苏省淡水渔业重点养殖县——宝应县异育银鲫疱疹病毒病发生流行情况,对相关病害发病历史、发病季节、主要危害对象、发病症状与病理变化、分子生物学诊断检测和有关鱼类疱疹病毒病与防治做了调查、研究与阐述,旨在引起国内相关养殖业主、科研工作者提供有价值周的的信息。
摘要:本文首先对水生经济动物新型病原微生物-螺原体的命名和基因组学的初步研究进行了概述。其次,利用选择性捕获转录序列技术对病原相关功能基因和非编码RNA进行了研究,并对螺原体病原对虾蟹侵染机制,病原对脊椎动物(鸡胚,乳鼠)感染特性等方面做了阐述。最后,就水产病原快速检测与螺原体疫病防治技术的应用进行了概述。
[成果] 1400460356 江苏
[S945.4, S947.1] 基础研究 [农业科学研究与试验发展, 渔业服务业] 公布年份:2013
成果简介:本项目属于水产养殖学研究领域中的水产病害防治方向。本研究项目简介:虾蟹是我国重要的经济水生甲壳动物,但虾蟹病害尤其是新型病害一直制约着水产养殖业的发展。中华绒螯蟹(俗称河蟹)“颤抖病”是近年来危害最为严重的疫病之一,2008年被农业部列为三类水产动物疫病。本项目应用微生物学、分子生物学、免疫学及细胞生物学等技术证实该病致病原是一种新型水产动物病原微生物——螺原体,这是国际上首次发现水产螺原体病原。本项目围绕这一原始发现开展了一系列研究:1.分离鉴定了河蟹螺原体病原,命名了新种并建立了新的血清族,菌株获得国家发明专利;2.除河蟹外,在克氏原螯虾(俗称小龙虾)、凡纳滨对虾(俗称南美白对虾)、罗氏沼虾及日本沼虾(俗称青虾)中也相继发现了螺原体病原,揭示螺原体在经济水生甲壳动物中的广泛分布和危害;3.明确了螺原体侵染虾蟹的靶组织、侵染途径和在体内的增殖方式,建立了这些动物的螺原体感染模型;4.开展了河蟹螺原体比较基因组学研究,并对河蟹螺原体与结构和致病相关的功能基因进行了筛选和研究,初步揭示了螺原体的分子致病机理;5.建立了虾蟹螺原体病原的五种不同的检测技术,其中基于ELISA方法研制的虾蟹螺原体快速检测试剂盒可以用于水产养殖现场快速诊断,便于推广应用;6.针对螺原体病原,开展了有效药物的筛选和药敏、药效、药代动力学的研究,建立了科学用药和有效防治螺原体疫病的实用技术,并在多家基层单位推广应用,取得了明显的经济效益、社会效益和生态效益。本研究项目来源:1.中华绒螯蟹颤抖病病原体生物学特性及传播途径的研究(国家自然科学基金30371118,2004.01-2006.12);2.虾蟹新型病原--螺原体的系统分类和致病机理研究,国家自然科学基金30771649,2008.01-2010.12);3.水生甲壳动物新型病原微生物--螺原体几种重要功能基因的筛选和研究(国家自然科学基金30870090,2009.01-2011.12);4.水产螺原体疫病的快速诊断和防治技术的集成与应用(江苏省科技厅重大项目BE2007343,2007.09-2009.12);5.中华绒螯蟹颤抖病致病因子及防治技术的探索(江苏省科技厅科技兴海项目BL2000305,2000.09-2002.12);6.中华绒蟹颤抖病病原的分子生物学鉴定,江苏省科技厅自然基金项目BK2002024,2002.09-2004.12);7.虾蟹螺原体病害的快速检测和防治技术的集成与示范推广(江苏省水产三项工程项目J2009-43,2009.09-2011.12)。本研究项目成果:1.本项目经过江苏省科技情报研究所科技查新咨询中心查新检索及南京师范大学图书馆信息咨询部检索。发表论文32篇,其中20篇为SCI收录期刊,8篇代表论文在Web of Science他引(文献被除作者及合作者以外其他人的引用)总次数为91次;2.获得国家发明专利4项;3.完成江苏省科技厅组织的科技成果鉴定(苏科鉴字[2005]第749号)和项目验收(苏科验字[2009]第788号)各1项;完成江苏省教育厅组织的成果鉴定(苏教鉴字[2012]第17号)1项及江苏省海洋与渔业局组织的项目验收(苏海科验字[2012]第78号)1项。江苏省科技厅和教育厅组织的两项鉴定成果均被鉴定委员会评为国际领先水平。
[成果] hg06124017 江苏
S917.4 基础研究 农业科学研究与试验发展 公布年份:2006
成果简介:蟹颤抖病是我国水产养殖重大流行病,随着克氏螯虾、南美白对虾等虾类的扩大养殖,近年来许多重大病害也时常暴发流行,这些都给水产养殖业带来重大损失,所以尽快明确致病因子,有针对性地进行防治是生产实际迫切需要解决的问题,项目运用微生物种类谱系分析“金标准”16S rRNA基因分析方法确定了蟹颤抖病和虾类(克氏螯虾、南美白对虾等)重大流行病病原为螺原体,并进行了柯赫氏法则(Koch's Rule)验证,这是一种新型水生动物病原,国际上首次在水生动物体内发现螺原体病原微生物,明确了虾蟹重大流行病病原;建立了螺原体病原的光镜、分子生物学及免疫学快速检测技术。
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