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[硕士论文] 吴雪臣
动物学 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:从出生到青春期,作为雌性配子的卵母细胞一直停滞在第一次减数分裂的前期,又称生发泡(Germinal Vesicle,GV)期。只有在青春期后,受到激素刺激的卵母细胞才会发生生发泡破裂(Germinal Vesicle Breakdown,GVBD),进而开始恢复减数分裂,而只有恢复减数分裂并发育成熟的卵母细胞,才有可能与精子结合形成受精卵。哺乳动物卵母细胞中,磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDEs)水平的变化引起的环腺苷酸(cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)水平的下降被认为是引起GVBD的主要原因。cAMP相关抑制剂如PDEs抑制剂和cAMP激活剂等,能可逆地抑制GVBD。
  本研究选用PDEs抑制剂Milrinone(Mil)、3-Isobutyl-1-Methylxanthine(IBMX)和cAMP激活剂Forskolin、dibutyryl cAMP(dbcAMP)四种药物分别进行单独或组合使用,以便于我们摸索出一套对卵母细胞成熟抑制效果最佳、对卵母细胞毒性最小的抑制剂配方。结果表明,在单独使用每种抑制剂的实验中,Mil,IBMX,Forskolin和dbcAMP能够达到抑制GVBD的最小浓度分别为3.0μM、30.0μM、450.0μM和150.0μM。为了进一步验证将各类抑制剂组合使用,能否获得更佳的配方,我们将不同种类和浓度的抑制剂进行组合,结果发现50.0μM Forskolin+0.3μM Mil,50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX,50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil,50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX四种组合能够获得更好的抑制GVBD效果。在此基础上,以不含任何抑制剂的培养液为对照组,含有不同种类抑制剂的培养液作为实验组,对卵母细胞的GVBD进程进行了检测,结果发现,含有抑制剂的实验组与对照组相比,GVBD进程不完全一致,但各组的最终GVBD率没有显著差异。比较了不同抑制剂对卵母细胞第一极体(First Polar Body, PB1)排放的影响,结果显示,三个实验组在PB1排放速率和最终排放率上与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μMdbcAMP+10.0μM IBMX;另有三个实验组只在最终PB1排放率上和对照组没有显著差异,包括:150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+0.3μM Mil。此外,我们比较了各组之间排放的PB1体积,结果发现,经50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μMIBMX或50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX三组处理过的卵母细胞所排放的PB1体积较小,并且与对照组没有显著差异。检测了抑制剂对卵母细胞早期凋亡、DNA损伤和线粒体分布的影响,结果发现,经五种抑制剂处理卵母细胞后,其早期凋亡率与对照组没有显著差异,包括:30.0μM IBMX、150.0μM dbcAMP、50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。经三种抑制剂处理卵母细胞后,其DNA损伤程度与对照组没有显著差异,包括:50.0μM Forskolin+0.3μM Mil、50.0μM Forskolin+10.0μM IBMX、50.0μM dbcAMP+10.0.μM IBMX。在线粒体分布指标方面,只有50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX组与对照组没有显著差异。研究表明:不同种类抑制剂经过浓度调整和组合使用,可以更好的将卵母细胞阻滞在GV期,并且对卵母细胞的毒性作用最小。由此,我们摸索出了新一代最佳抑制剂组合,即50.0μM dbcAMP+10.0μM IBMX。这一配方可为日后研究卵母细胞成熟机理提供有效帮助。
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