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摘要:高质量的DNA是进行分子生物学研究的基础.通过对传统DNA抽提方法(酚-氯仿法)进行改进,并以Rhodococcus sp.R04和煤粉为实验材料对细胞破碎条件进行优化,建立了一种可用于煤地质环境微生物基因组DNA高效提取的改良方法.以改良法和商业试剂盒提取煤地质环境微生物基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、细菌及古菌特异性片段的PCR扩增来评价所提取DNA的质量.改良法和试剂盒法均能获得煤地质环境微生物基因组DNA,并能用于多种特异性PCR扩增.与试剂盒提取的DNA相比,改良法获得的DNA片段主带明显,约占总DNA含量的50%,分子量大小接近23 kb,并且提取量大,约为试剂盒的5-10倍.同时,能用于如DNA文库构建和宏基因组测序等.此外,改良法所用试剂普通,价格便宜,提取的煤地质环境微生物基因组DNA质量较高,适于实验室和科学研究.
摘要:[目的]分析沁水盆地煤层气田不同煤层气井产出水样中产甲烷菌群和生物成因气的生成途径.[方法]以甲基辅酶M还原酶基因(mcrA)作为目标基因,采用454焦磷酸高通量测序方法,同时比对NCBI功能基因文库中的mcrA序列,分析不同煤层气井产出水中的产甲烷菌群.[结果]高通量测序表明,5个出水样产甲烷菌群OTUs (Operational taxonomic units)数为64-157个,共有的为22个,各占样品总数14%-34%;样品共检测到4种已知菌属,即甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷叶菌属(Methanolobus)和甲烷螺菌属(Methanospirillum),优势菌属均为Methanobacterium.系统发育分析表明,未明确地位的菌属主要与Methanobacterium、Methanomicrobium、产甲烷球菌属(Methanococcus)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)有较近的亲缘关系.5个样品中菌属所占比例不同,检测到的菌属类别大致相同.所有检测样品生物成因煤层气(Coalbed methane,CBM)的生成途径主要为氢营养型产甲烷途径.[结论]沁水盆地不同煤层气田产甲烷菌群菌种差异比较大,但生物成因气生成途径基本相似,与地理位置和煤藏条件没有相关性.
[硕士论文] 吴瑞薇
生物化学与分子生物学 山西大学 2017(学位年度)
摘要:煤层气(CBM)作为一种自生自储形式存在的非常规天然气,以清洁、高效、优质、安全的特点越来越受到人们的关注。近年来,生物成因煤层气作为一种环境友好及高效的能源,被人们广泛研究。针对煤层气相关微生物多样性及产气途径的研究对煤层气的开采、废弃煤层气田的处理和煤层气的再生有重大意义。而在我国,由于煤层气的勘探研究起步较晚,在煤层气相关微生物的研究方面报道甚少。本文中,以山西沁水盆地煤层气田为研究对象,该地区为我国煤层气开采最为活跃的地区,采用高通量测序技术,对煤层气田原位产出水和异位煤生物转化成甲烷的过程中微生物的群落变化进行了研究,同时也对以高阶块煤为基质中试模拟生物产气过程中,培养基的浓度和添加块煤的量对微生物群落结构的影响进行了初步研究。
  微生物基因组总DNA的提取是进行环境分子生态学研究的首要关键步骤。煤是具有复杂和难降解结构的大分子物质,因此提取高质量的基因组总DNA是后续实验的关键,也是能较真实的评估微生物多样性的保障。通过优化在该特殊环境中基因组DNA的提取方法,即采用the Mini-Bead Beater机械破碎、化学破碎与酶消化相结合,得到了高浓度、片段完整的基因组总DNA,能满足后续相关的PCR扩增和宏基因组学测序分析。
  首先分析了该煤层气田5个不同煤层气井原位产出水中产甲烷菌群和生物成因气的生成途径。以甲基辅酶M还原酶基因(mcrA)作为目标基因,采用454焦磷酸测序方法,分析不同煤层气井产出水中的产甲烷菌群。高通量测序表明,样品共检测到4种已知菌属,即甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷微菌属(Methanomicrobium)、甲烷叶菌属(Methanolobus)和甲烷螺菌属(Methanospirillum),优势菌属均为Methanobacterium。系统发育分析表明,未明确地位的菌属主要与Methanobacterium、Methanomicrobium、产甲烷球菌属(Methanococcus)和甲烷囊菌属(Methanoculleus)有较近的亲缘关系。
  同时成功利用高阶块煤首次实现异位煤生物转化成甲烷的过程,该过程通过规模化中试发酵培养更加客观的表征了微生物的群落变化。通过高通量测序分析表明在原位产出水中氢营养型的产甲烷菌Methanocalculus占主导,而在异位产气过程中乙酸型产甲烷菌Methanosaeta和Methanosarcina占主导;在原位产出水和异位产气过程中大部分细菌均属于Proteobacteria,在产出水中细菌属Sulfuricurvum, Hydrogenophaga和Methylobacter占主导;而在异位产气过程中细菌菌属差异较大,由起初的Pseudomonas为优势菌属,到后来发酵培养90天后,主要的细菌为Proteocatella,Macellibacteroides和Clostridium。
  综上,在煤层出水样中生物成因煤层气的形成主要为氢营养型产甲烷途径,而在异位煤的生物转化过程中主要为乙酸型产甲烷途径,因此在异位生物成因的产气途径判定中不能依据原始微生物群落代谢途径而决定,而应以所研究的微生物群落中优势产甲烷菌作为参考依据。
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