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EI CSTPCD 北大核心 SCI
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摘要:利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系,并将其用于核酸的检测.在该体系中,茎环结构定位探针首先是内切酶Tth Endonuclease Ⅳ的作用底物,被剪切后又作为定位探针介导切口酶Nt.BstNBI对分子信标实施剪切,将这2步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖,同时进一步提高了检测灵敏度.实验结果表明,荧光信号与目标DNA浓度的对数值呈线性相关,响应范围为1 pmol/L~1 nmol/L,并且具有良好的识别单碱基变异的能力.此外,本方法序列设计简单,通用性强,仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标DNA的检测.对掺杂于血清中的目标DNA的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力....
[博士论文] 吴望华
控制科学与工程 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:癌症的过程研究阐明了癌症的发生、发展及其演变过程中的相关机理,对癌症的诊断、干预和治疗具有指导性作用,其中,对癌症的相关生物标志物的检测是癌症的过程研究中最有效的途径之一。核酸是一种非常重要的癌症标志物,对其进行有效筛查和高灵敏检测对癌症的过程研究和控制具有十分重要的意义。因此,对复杂样品中的痕量核酸进行扩增和检测受到了越来越多的关注,尤其是核酸等温扩增技术。自1990年以来,大量的核酸等温扩增方法被陆续开发出来,并且被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等的检测。其中,基于切口内切酶(Nicking Endonucleases,NEases)的等温扩增方法,如链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、指数等温扩增反应(Exponential Isothermal Amplification Reaction,EXPAR)和切口内切酶信号放大(Nicking Endonuclease Signal Amplification,NESA)等由于简单、快速、高效等优点始终是近年来的研究热点。但是,NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖构成了这类方法的瓶颈,因此,如何向扩增体系中引入NEases的特异性识别位点仍是这些方法面临的共同挑战;另外,对制约等温扩增方法检测灵敏度的非特异性扩增效应的有效抑制也是非常棘手的难题。针对上述问题,本论文首先发展了一种DNA定位探针(DNA-Aligner,DA)介导剪切技术(Aligner-Mediated Cleavage,AMC),克服了NEases对目标核酸分子中特定识别序列的依赖问题;在此基础上,提出了基于AMC的两种新型等温指数扩增方法,并对新方法中存在的非特异性扩增效应进行研究和抑制,进一步提高了方法的稳定性和灵敏度;此外,还利用DA介导的等温扩增反应和空间位阻效应建立了一种简便、快速和均相的蛋白检测方法。主要研究内容包括以下几个方面:
  第一章概述了近年来发展的主要等温扩增方法。重点阐述、分析了基于NEases的等温扩增方法的原理、应用和存在的问题,并在此基础上提出了本论文的研究内容。
  第二章发展了一种定位探针介导剪切技术(AMC)。定位探针(DA)包括茎-环结构和两单链侧臂,其中茎上含有NEases的识别位点;NEases首先结合在DA茎的识别位点上,再通过DA两侧臂与目标序列的杂交被定位至待剪切位点处进而实施剪切。该方法克服了NEases对目标核酸分子中特异性识别位点的依赖,仅使用一种NEase,通过调节DA在目标序列上的杂交位置就可以实现在任一位置处的精确剪切,且剪切位点可以逐个碱基调节。
  第三章采用AMC技术发展了一种新型等温链置换扩增方法(Aligner-Mediated Cleavage-Based Strand Displacement Amplification,AMC-SDA)。相较于传统的SDA,AMC-SDA具有以下特点:由于AMC优异的通用性,该方法也具备很强的通用性,理论上可以实现对目标序列中的任一片段的扩增和检测;引物的3'封端处理在一定程度上抑制了“引物二聚体”效应,可以获得较高的灵敏度,此外引物设计也因此大幅简化。对质粒和实际HBVDNA良好的检测性能证明了AMC-SDA具有很好的应用前景。
  第四章对AMC-SDA进行了优化,进一步提高了方法的检测灵敏度和重现性。通过对DA的改进和在引物中引入硫化和脱碱基位点等手段,消除了DA/引物沿着目标序列延伸对阳性扩增的不利影响、抑制了DA/引物3'封端的降解和体系的非特异性扩增效应,可将AMC-SDA的检测下限降低至10-17M水平,且方法的重现性也大幅提高。
  第五章采用AMC技术发展了一种新型指数等温扩增方法(AMC-Triggercd Exponential Amplification,AMCEA)。相较于传统EXPAR,由于AMC可以在任一位点处将目标序列剪切以产生触发引物,因此AMCEA具有十分优异的通用性,可以更灵活地应用于各种核酸片段的扩增和检测,其对血清中目标DNA的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。
  第六章将DA可调节等温扩增反应速率的特性与空间位阻效应相结合,提出了一种空间位阻效应调节的等温扩增方法(Steric Effect-Regulated EXPAR,SER-EXPAR)并用于蛋白质的检测。SER-EXPAR可以高特异性地检测纳摩尔浓度的目标蛋白,是一种一步、快速和均相的蛋白检测方法,其对血清中目标蛋白的检测结果也证明了该方法具有一定的应用潜力。
  第七章对本论文的创新点进行总结并对以后的研究提出了展望。
[专利] 发明专利 CN201610285142.6
浙江大学 2016-11-09
摘要:本发明涉及生物技术领域,为解决目前蛋白的快速实时检测中ELISA等检测方法复杂耗时费试剂的缺点、电化学检测方法的非特异性吸附和界面修饰等缺点,本发明提出了一种蛋白实时定量检测方法,将待测蛋白样本、修饰了待测蛋白识别小分子的亲和素或链霉亲合素、调节探针、扩增模板、切口酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、氯化镁、SYBR?Green?I?荧光染料制成混合溶液,在等温条件下进行扩增反应,将待测蛋白浓度与等温扩增曲线的出峰时间之间建立定量关系,实现蛋白的实时定量检测。本方法具有简单、特异性高、通用性强和可以实时定量检测等优势,其检测限能达到亚纳摩尔级,可以满足一般的蛋白检测要求。
[专利] 发明专利 CN201510270367.X
浙江大学 2015-09-16
摘要:本发明公开了一种核酸定位探针及其在核酸剪切中的应用,该核酸定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链,所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区,所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明采用特定结构的核酸定位探针,实现了核酸剪切,提供了一种简单通用的核酸剪切方法,该方法中内切酶在核酸定位探针的帮助下可以在目标核酸序列的任意指定位置实现精确可调的剪切,具有简单、通用、精确、可调等优势,有望为生物、医学和化学等领域研究中的核酸剪切提供有效手段。
[专利] 发明专利 CN201610279942.7
浙江大学 2016-10-26
摘要:本发明涉及生物技术领域,为解决目前蛋白的快速实时检测中ELISA等检测方法复杂耗时费试剂的缺点、电化学检测方法的非特异性吸附和界面修饰等缺点,本发明提出了一种蛋白定量检测方法,将待测蛋白样本、调节探针、扩增模板、切口酶、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I荧光染料制成混合溶液,在等温条件下进行扩增反应,将待测蛋白浓度与等温扩增曲线的出峰时间之间建立定量关系,实现蛋白的实时定量检测。本方法具有简单、特异性高、通用性强和可以实时定量检测等优势,其检测限能达到亚纳摩尔级,可以满足一般的蛋白检测要求。
[专利] 发明专利 CN201510272558.X
浙江大学 2015-08-26
摘要:本发明公开了一种基于定位探针介导剪切的核酸等温扩增方法,该方法包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应,所述酶切目标核酸序列所采用的试剂包括上、下游的定位探针和内切酶,所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链,所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区,所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明方法具有简单、特异性高、灵敏度高和通用性强等优势,彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖,解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题,降低了目前等温扩增方法中引物设计的难度,有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围。
[专利] 发明专利 CN201510270704.5
浙江大学 2015-09-02
摘要:本发明公开了一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法,该方法包括酶切目标核酸序列、指数扩增反应,所述酶切目标核酸序列所采用的试剂包括定位探针和内切酶,所述定位探针包括一段双链以及至少一段与双链相连接的单链,所述单链具有可与目标核酸序列特异性杂交的识别区,所述双链具有邻近识别区的供内切酶结合的结合区。本发明方法具有简单、特异性高和通用性强等优势,彻底克服了内切酶对目标核酸序列中特定识别序列的依赖,解决了目标核酸序列任意剪切继而引发扩增的难题,降低了目前等温扩增方法中引物设计的难度,有望拓宽等温指数扩增技术的应用范围。
摘要:微波灭菌是实现安全、可靠、高效灭菌的一种有效方法,本文对微波灭菌的原理和其相关应用等方面作了简单的综述并展望了其发展前景。
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