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[硕士论文] 吴晓婷
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:在世界范围内,口腔癌约占全世界恶性肿瘤的3%,口腔癌中以舌癌最常见。虽然科学技术的飞速发展使医疗水平不断提升,舌癌的治疗手段也因此得到不断改善,但患者的五年生存率仍然不高,术后的生存质量也不尽如意。因此,从分子水平研究舌癌发生发展、侵袭转移的分子机制,以期望实现舌癌的分子靶向治疗、提高患者生存质量和预后成为研究的热门。本课题组前期通过转录组测序发现基质金属蛋白酶MMP-10、MMP-13在舌癌组织中相对高表达,与舌癌密切相关。因此,本课题拟通过研究抑制MMP-10、MMP-13基因后舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭、迁移能力的变化,进一步明确它们在舌癌中发挥的作用,并探讨其可能的机制,为舌癌的治疗提供新思路。
  目的:研究抑制MMP-10、MMP-13对舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭迁移能力的影响,为舌癌基因靶向治疗提供理论基础和临床依据。
  方法:第一部分:筛选及进一步验证舌癌癌及癌旁组织差异基因。由上海众信生物技术有限公司通过对5对舌癌患者的癌组织和癌旁组织进行基于NGS的RNA-seq测序,初步筛选出部分差异基因MMPs;将收集的舌癌及癌旁组织标本应用qRT-PCR方法对差异基因MMPs进行进一步验证。第二部分:探讨抑制MMP-10、MMP-13基因对舌癌细胞株CAL-27生物学行为的影响。用针对MMP-10和MMP-13基因序列分别设计合成相应的siRNA,转染CAL-27细胞,通过Real-time PCR技术检测两个基因在RNA水平的表达变化,筛选出两条干扰效果较好的siRNA;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)验证两个基因在蛋白水平的表达变化。运用CCK8法和平板克隆形成实验研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞增殖能力的改变;采用划痕愈合实验及侵袭小室法研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞迁移、侵袭能力的改变。第三部分:建立动物模型观察抑制舌癌高转移细胞株MMP-10表达后癌细胞在裸鼠体内转移能力的改变。构建靶向抑制MMPs基因的慢病毒载体,感染舌癌高转移细胞株,建立裸鼠舌部原位癌模型,观察及计算各组的淋巴结转移率。
  结果:第一部分:RNA-seq测序结果显示5对癌组织中MMP-10、MMP-13相对高表达,应用qRT-PCR方法进一步验证也发现两个基因在大部分舌癌组织中相对高表达。第二部分:siRNA-MMP-10/siRNA-MMP-13转染CAL-27细胞后,Real-time PCR及Western blot结果显示相应的MMP-10/MMP-13在RNA水平及蛋白水平表达下调;CCK8法和平板克隆形成实验显示siRNA-MMP-13转染后细胞增殖能力明显低于阴性对照组;划痕愈合实验、侵袭小室结果表明,MMP-10/MMP-13表达下降后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力也随之下降。第三部分:慢病毒抑制稳转细胞组1336组MMP-10蛋白较NC组表达下调,迁移能力较NC组降低,我们选择1336组稳转细胞和NC组稳转细胞进行动物实验发现1336组裸鼠淋巴结转移率较NC组下降。
  结论:MMP-10、MMP-13在癌组织中相对高表达;抑制MMP-13基因后CAL-27细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱;抑制MMP-10基因后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力均减弱;MMP-10、MMP-13基因可能对人舌鳞癌的增殖、迁移和侵袭起到一定的促进作用。
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