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[博士论文] 吴昊
外科学(骨外科) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:成骨细胞-破骨细胞正常的功能偶联是骨折愈合的重要因素,骨折局部感染可导致骨折不愈合,局部感染会引起骨折断端成骨细胞及破骨细胞功能异常,进而干扰正常的成骨细胞-破骨细胞偶联,使断端出现游离死骨,死骨形成后导致感染难以控制形成恶性循环,最终导致骨折不愈合。因此临床又把感染导致的骨折不愈合称之为难治性骨折不愈合。骨折感染通常为混合感染,革兰氏阴性菌参与其中,脂多糖(LPS)是构成革兰氏阴性菌细胞壁主要的成分之一。但是脂多糖是否能干扰成骨细胞的正常功能导致偶联失调,及其相应的具体机制尚不明确。JAK-STAT信号通路作为一个重要的细胞信号通路在成骨细胞的发生、成熟、分化和凋亡中发挥着重要的作用。根据文献报道及本实验的研究结果,证实细菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信号通路,继而干扰成骨细胞正常的分化功能;阻断JAK2/STAT5信号通路可逆转细胞脂多糖对于成骨细胞分化功能的影响。
  目的:
  1.体外实验。研究不同浓度脂多糖对成骨细胞活性、成骨功能指标的影响,为寻找脂多糖作用成骨细胞的靶点提供分子生物学研究基础。
  2.培养MC3T3-E1细胞,以不同浓度LPS处理,结合JAK2-siRNA,检测成骨细胞活性、成骨功能指标的影响,为寻找治疗细菌感染导致的骨不连的药物靶点提供分子生物学研究基础。
  3.体内实验。建立动物感染骨折愈合模型,分为对照组、炎症组、治疗组,观察骨折愈合过程情况、检测骨折处骨密度、骨小梁分离度等指标的变化,检测骨折处软骨化骨程度、成骨细胞数量的变化,说明JAK2-STAT5信号通路在脂多糖是否影响成骨细胞生长分化中发挥作用,为治疗细菌感染导致的骨折不愈合垫定实验基础。
  方法:
  第一部分:
  1.体外培养MC3T3-E1细胞系。
  2.成骨细胞骨矿化结节染色,碱性磷酸酶活性检测。
  3.人类重组骨形态发生蛋白2(BMP-2),RunX-2蛋白及Ⅰ型前胶原氨基端前肽的含量检测。
  4.MTT法细胞活性检测。
  5.免疫印迹法检测脂多糖干扰成骨细胞中TLR-2、TLR-4、STAT5b蛋白的表达。
  第二部分:
  1.细胞系培养。
  2.siRNA的转染。
  3.免疫印迹法检测转染后JAK2表达水平。
  4.JAK2-siRNA转染成骨细胞骨矿化结节染色的检测。
  5.RT-PCR法检测TLR2,TLR4的mRNA水平。
  6.酶联免疫吸附试验检测ALP,RUNX,BMP-2和PINP蛋白水平的变化。
  第三部分:
  1.动物骨折模型及内固定手术。
  2.X线检查骨折愈合情况,Micro-CT检测骨折部位骨密度(BMD)及骨小梁分离度(Tb.Sp)。
  3.番红固绿染色观察检测软骨细胞骨化成骨程度。
  4.HE染色、OCN免疫组化染色观察检测成骨细胞的数量。
  统计分析
  采用软件IBM SPSS Statistics21进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示。对于基本符合正态分布或者偏正态分布的数据,2组或2组以上组间均数比较分别采用独立样本t检验和单因素方差分析。对于不符合正态分布的数据,2组或2组以上组间均数比较分别采用两独立样本非参数检验和多个独立样本非参数检验,检验方法分别为Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验。P<0.05表示有统计学差异。
  结果与结论:
  1.LPS诱导成骨细胞矿化点呈浓度依赖性下降。
  2.LPS干扰成骨细胞,成骨细胞细胞活性降低,活性碱性磷酸酶水平降低。成骨分化相关蛋白RUNX2,BMP-2和PINP表达量逐渐递减,且与LPS呈浓度依赖性。
  3.不同浓度LPS干扰成骨细胞后TLR2,TLR4的mRNA与蛋白表达升高,p-STAT5b和JAK2的蛋白表达上升,并且均呈剂量依存性。
  4.siRNA-JAK2转染成骨细胞,JAK2的mRNA和蛋白表达水平下降。
  5.LPS干扰siRNA-JAK2转染成骨细胞骨后,转染组矿化点高于未转染组。RUNX2,BMP-2和PINP蛋白表达上升。
  6.术后2周小鼠胫骨骨折骨折愈合,对照组、治疗组中软骨细胞骨化程度高于炎症组,炎症组愈合过程较对照组与治疗组滞后。
  7.术后2周骨折区域骨密度对照组、治疗组均高于炎症组。骨小梁分离度对照组、治疗组均低于炎症组。
  8.术后2周、4周对照组、治疗组中成骨细胞个数较炎症组多,成骨活跃。
摘要:目的 应用经皮导引抽出钢丝(或肌腱缝合线)法对锤状指进行微创手术治疗. 方法 选择9例骨性、6例腱性锤状指患者,采用以10ml注射针头经皮穿过骨性、骨-软组织隧道环穿末节指骨基部骨质,自背侧刀口导引出钢丝或肌腱缝合线,将在止点部位的撕脱骨块或断裂的伸肌腱直接固定在指骨上的微创手术进行治疗. 结果 15例患者术后关节伸、屈功能良好,无疼痛.采用Crawford功能评定法评定:优7指,良5指,可3指.优良率80%. 结论 经皮导引抽出钢丝或肌腱缝合线法对锤状指的微创手术治疗具有以下优点:①不需扩大暴露切口远端皮肤的远指间关节背侧横向“S”刀口就可以满足手术需要.②允许有足够的骨量钻取骨隧道来满足钢丝或肌腱缝合线的悬挂强度(尤其对于关节面有较大的撕脱骨块病例).③骨隧道钻取部位可根据需要选择,以满足使钢丝力线垂直于骨折线....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST SA
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摘要:Bayesian方法或最大后验(maximum a posteriori,MAP)法被认为是解决图像重建中的病态问题的有效方法.根据Bayesian理论,目标图像的先验信息被加诸于图像重建中来抑制噪声.然而,大部分的先验模型提供的先验信息来自于一个较小的局部邻域内灰度值的简单加权差,只能对Bayesian重建提供有限的先验信息.本文提出一个新的非局部的且具有二次的先验能量方程的马尔可夫随机场(Markov Random Fields,MRS)先验,该先验通过选择较大邻域和新的加权方式来充分利用图像的全局信息.文章同时还提出使用该非局部先验的Bayesian重建的迭代算法.最后给出了该先验在PET(正电子发射成像)重建中的应用.实验结果以及同其他先验的比较证明该先验在降低噪声效果和保持边缘方面具有很好的表现....
摘要:目的:研究S100钙结合蛋白A4(S100A4)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和正常人膝关节滑膜中的表达水平,以及S100A4对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes, RAFLSs)促进血管生成的影响.方法:滑膜分别取自RA患者(RA组)及正常人(control组)膝关节,免疫组化法观察S100A4和VEGF蛋白在2组滑膜中的表达情况.RAFLSs分离自活动性RA滑膜;ELISA法检测S100A4刺激RAFLSs分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用;用rhS100A4孵育RAFLSs的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),检测S100A4体外血管生成能力.结果:S100A4及VEGF蛋白在RA组滑膜中高表达(P<0.05),rhS100A4显著刺激RAFLSs分泌VEGF,呈时间和剂量依赖性(P<0.05);rhS100A4孵育RAFLSs的条件培养基可促进HUVECs在体外形成管腔.结论:S100A4蛋白在RA患者膝关节滑膜中高表达,S100A4可通过促进RAFLSs分泌VEGF来刺激滑膜血管生成.这些结果提示S100A4可作为治疗RA的潜在靶点....
摘要:目的 探讨软骨细胞-动物源性骨软骨支架复合体修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性和影响因素.方法 将改良贴壁离心法获取的骨髋间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)/绣导分化的软骨细胞共培养后与经深低温冷冻、脱脂、脱钙、真空冷冻干燥和辐照消毒的动物源性骨软骨支架复合,构建共培养细胞+软骨-骨-体化复合支架.27只新西兰大白兔随机分为实验组(A组)、对照组((B组)和空白组(C组),每组9只.于兔股骨髁间窝处钻一深6mm的骨软骨复合缺损,A组植入共培养细胞+骨软骨复合支架,B组植入骨软骨复合支架,C组不植入任何支架材料和细胞,分别于术后4周、8周和12周取材,行大体观察、苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色,并对各标本的软骨切片进行组织学评分.结果 随着时间的延长,A组大体观察见复合缺损区己完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合;B组新生组织仍不能完全填充缺损;C组缺损区仍明显.苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见A组软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞呈柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好;B组新生软骨细胞无软骨陷窝,排列混乱,各界面藕合欠理想;C组可见陈旧性肉芽组织生长并突出于缺损区表面.甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分结果表明,A组与B.C两组之间的差异具有统计学意义(P<0.05).结论 BMSCs/诱导分化的软骨细胞共培养细胞复合动物源性骨软骨支架对兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损具有修复作用....
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