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[博士论文] 吴忠霞
细胞生物学 中国科学技术大学 2016(学位年度)
摘要:保幼激素(juvenile hormone,JH)除了在昆虫幼虫阶段拮抗蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的作用而决定昆虫蜕皮或变态之外,它还在许多昆虫的成虫羽化后起促进生殖的作用,但对JH促进生殖的的分子机制仍缺乏了解。飞蝗(Locusta migratoria)是世界性的重要农业害虫,有很强的繁殖能力。不同于果蝇、伊蚊、家蚕、赤拟谷盗等研究对象的生殖由JH和20E共同调控,飞蝗的卵黄发生、卵巢发育和卵成熟则由JH调控。因此,飞蝗也是研究JH调控昆虫生殖分子机制的一个理想模式。飞蝗的卵巢属于无滋式(panoistic),即卵小管没有滋养细胞或滋养丝,卵成熟所需的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)等由脂肪体合成,通过血淋巴和卵泡细胞的胞间隙运送到成熟过程中的卵母细胞。早期的研究发现,飞蝗羽化后到产卵前的第一个促性腺周期内,脂肪体和卵泡细胞进行内分裂(endocycle),形成高达16倍体的多倍性(polyploidy)细胞,为飞蝗生殖发育所必需,也受JH调节,但不清楚其中的分子调控机制。
  为了解码JH调控飞蝗生殖的分子机制,课题组通过RNA-seq方法获取了JH缺失和JH诱导脂肪体的差异基因表达谱。KEGG通路分析表明,DNA复制和细胞周期信号通路分别位列第一和第四。QRT-PCR验证了DNA复制通路的16个基因和细胞周期通路中的13个基因都在JH诱导下显著上调。本论文首先选择在DNA复制中起核心作用的6个复制解旋酶基因(Mcm2-7)开展进一步的研究。对JH受体Met基因进行RNAi后,发现Mcm3、Mcm4和Mcm7表达水平显著下降。对Mcm4和Mcm7的启动子区域进行序列分析,分别鉴定到Met结合的E-box-like和E-box元件。荧光素酶报告和电泳迁移实验均证明JH受体复合体(Met/SRC)可以结合Mcm4和Mcm7上游的E-box或E-box-like序列,直接调控Mcm4和Mcm7的转录。通过RNAi沉默Mcm4或Mcm7,脂肪体细胞的DNA复制和细胞多倍化严重受阻,Vg表达大幅度下调,卵巢发育和卵母细胞成熟受到显著抑制,表型与JH缺失和Met RNAi相似。这些研究结果表明,Mcm4和Mcm7在JH调控的飞蝗生殖发育中发挥重要作用,JH通过其受体复合体Met/SRC直接调控Mcm4和Mcm7的表达,影响细胞的DNA复制和多倍化,进而调节卵黄生成、卵巢发育和卵母细胞成熟。
  Mcm2-7加载到DNA复制起点形成复制前体依赖于Cdc6,而Cdc6在JH诱导的差异基因表达谱中也显著上调。鉴于Cdc6在DNA复制和细胞周期检控中的重要作用,本论文也对Cdc6在JH调节的飞蝗生殖发育中的功能和调控机理进行了研究。QRT-PCR结果显示,Cdc6的表达不但受JH诱导上调,也在MetRNAi后显著下调。对Cdc6基因上游的DNA序列进行克隆和分析,在启动子区域-1063到-1058处发现一个E-box-like元件。利用飞蝗脂肪体和果蝇S2细胞进行电泳迁移实验都证明Met可以结合Cdc6启动子区域含E-box-like元件的20bpDNA序列。荧光素酶报告实验表明,JH/Met/SRC直接调控Cdc6的转录。Cdc6RNAi和流式细胞实验显示,Cdc6缺失不但显著降低脂肪体细胞和卵泡细胞的倍性,也导致这些组织的细胞分裂;同时,Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟都受到非常显著的抑制;而且,上述表型缺陷在JH处理后并不能恢复到正常水平。这些研究结果表明,Cdc6参与JH调节的飞蝗细胞多倍化和生殖发育,在JH诱导下,Cdc6与Mcm4、Mcm7协同提高DNA复制和细胞的倍性,可能增加包括Vg在内的所有基因的拷贝数,进而促进Vg的大量合成,同步满足所有首卵的成熟。
  此外,本论文还对调控细胞内分裂的E2f1开展了初步研究。E2f1 RNAi造成脂肪体细胞和卵泡细胞的双核或多核化,并显著降低细胞的倍性。与Cdc6、Mcm4或Mcm7 RNAi相似,E2f1 RNAi后飞蝗的Vg表达、卵巢发育和卵母细胞成熟也受到显著抑制。论文的初步研究结果表明,E2f1在JH调控的飞蝗细胞多倍化过程中也发挥着非常重要的作用。以后对E2f1的进一步研究将会阐明JH怎样调控E2f1的表达,E2f1如何作用于飞蝗细胞的内分裂和多倍化。
  综合上述研究结果,特别是对JH通过Met/SRC直接调控Mcm4、Mcm7和Cdc6的表达,提高脂肪体细胞和卵泡细胞的多倍化,进而促进Vg的大量合成和卵成熟的解析,揭示了JH促进昆虫生殖的一个重要机制。
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