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摘要:为了研究分枝杆菌热休克蛋白(Hsp70)对猪圆环病毒2型(PCV2) Cap蛋白的免疫佐剂作用,以自聚肽ELK16为纯化标签,分别与Hsp70和PCV2 Cap基因融合后诱导表达,利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70,其纯度高达95%、96%和85%,产量分别为92、84和83 mg/L;接着用PBS、ELK16-Cap、ELK16-Cap+弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap+ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70分别免疫小鼠,初免后21 d ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平达到最高;在二免后2周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞,用试剂盒检测细胞因子表达,TNF-α浓度依次为588.55、802.55、995.55、1 382.55和1 719.55 pg/mL,IFN-γ浓度依次为46.30、92.22、155.56、470.37和518.15 pg/mL,IL-12浓度依次为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72 pg/mL.这些研究结果表明,Hsp70对刺激PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA,但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强,而ELK 16-Hsp70+ELK 16-Cap对3种细胞因子产生的刺激作用次之....
摘要:在单因素分析的基础上,以药液质量体积比、壳聚糖用量和作用温度为自变量,以固形物去除率和皂苷保留率为评价指标,设计了三因素三水平响应面法优化试验,研究壳聚糖用于三七茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺.结果表明,三七茎叶皂苷提取液除杂最佳工艺:药液质量体积比[生药质量(g):提取液体积(mL)]为1:6,壳聚糖(1% 溶液)用量(壳聚糖溶液体积与生药量之比)为0.8 mL/g,作用温度为65℃.三七茎叶皂苷提取液除杂工艺优化后,固形物去除率及皂苷保留率分别为26.09% 、96.10%,其RSD分别为1.54% 、0.69%,重现性较好,表明该模型有效....
摘要:根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验.结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100 fg,比常规PCR灵敏度高100倍.利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性.用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致.结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段....
摘要:研究三七皂苷S-6的溶血性及体外免疫活性.常规方法提取PNS,大孔树脂柱层析分离纯化得S-6.溶血试验测定红细胞溶血率.脾淋巴细胞毒性试验确定S-6的安全剂量范围,体外脾淋巴细胞增殖反应和IL-2的诱生及含量测定检测S-6的体外免疫活性.S-6溶血性较小,2 mg/mL浓度以下无溶血性;S-6(0.1μg/mL、1μg/mL)显著促进了Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应,且与PNS和APS组相比,差异不显著;S-6(1μg/mL)极显著地促进了LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应,且与PNS相比,S-6(1μg/mL)差异显著,其余各个剂量与PNS和APS组相比,差异不显著;S-6(12.5 μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)显著或极显著地提高了IL-2的含量,且与PNS和APS组相比,差异不显著.S-6安全性好,体外具有较好的细胞免疫活性和诱生细胞因子的能力....
摘要:环介导等温扩增(LAMP)技术是一种具有特异性强、灵敏度高、快速简便、扩增高效等优点的等温核酸扩增方法.近年来,该技术在许多方面得到了进一步的改进和发展,主要体现在多重LAMP技术的实现以及LAMP技术与其他技术的联合应用方面.对LAMP技术在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中的应用进展进行了综述,并对LAMP技术的应用前景进行了展望,为今后LAMP技术的发展及应用提供参考....
摘要:为研究线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu( TUFM)在不同毒力新城疫病毒( NDV)感染的鸡胚成纤维细胞( CEF)中表达水平的变化,运用比较蛋白质组技术分析感染了NDV的CEF差异表达的蛋白点。与24 h的阴性对照组相比,感染NDV后24 h时TUFM表达量在毒力最弱的WX?10?07?Pi感染组中显著升高;毒力最强的JS?5?05?Go引起宿主表达TUFM量随感染时间增加逐渐增强。推测TUFM的表达水平与NDV毒力强弱具有一定相关性。...
摘要:本研究根据GenBank中登录的鸭I型肝炎病毒( DHV I) VP1基因的高度保守序列,设计了特异性的引物,建立了一种灵敏、特异、高效的可视化体外环介导等温扩增方法( RT-LAMP)。结果表明,该方法的灵敏性可达到10 fg,是常规一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反应可以在1.0~1.5 h内完成,并可以直接通过肉眼观察颜色进行结果判定,该方法对其他鸭常见的病原体检测结果全部为阴性,该方法的建立为下一步研制鸭I型肝炎病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒打下基础。...
摘要:为建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,根据 GenBank 中公布的 DPV UL6基因组序列,设计了3对特异性引物,建立了 LAMP 快速检测方法。该方法的灵敏度可达0.1 fg,对其他鸭常见病原体检测结果均为阴性,扩增反应只需在水浴锅中60 min 内即可完成,可通过肉眼观察颜色变化直接判定结果。结果表明,所建立的 LAMP 方法简便快捷,省时省力,是适用于现场和基层实验室快速、准确检测 DPV 的分子生物学方法。...
摘要:为验证新城疫病毒(NDV)入胞过程存在胞吞途径,本研究以感染了NDV的鸡胚成纤维细胞(CEF)为研究对象,采用比较蛋白质组学研究方法,双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)分析3株NDV感染CEF后24 h和48 h两个时间点细胞蛋白表达动态.试验结果显示早期内体标志蛋白早期内体抗原1 (EEA1)表达水平变化显著,这表明NDV可通过胞吞途径进入细胞;与其它两株病毒相比,胞吞作用在JS-5-05-Go进入细胞的过程中,可以发挥更长时间的效应....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:脾脏是新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染的重要靶器官,本试验旨在从分子水平上分析NDV与宿主之间的相互作用,探寻早期基因Ⅳ型强毒Hefts/33和晚期基因Ⅶ型强毒JS5/05造成鹅脾脏病变差异的相关蛋白.30日龄非免疫鹅分别人工感染NDV强毒株Herts/33和JS5/05,并于感染后36、72、108 h采集2个感染组和对照组的鹅脾脏,提取脾脏蛋白,以17 cm、pH5~8的IPG胶条进行二维电泳,运用PDQuest 8.0.1软件对凝胶图谱进行差异蛋白分析.结果显示:与对照组相比,Herts/33感染组和JS5/05感染组脾脏组织分别有154个和148个蛋白出现了显著的差异表达,其中有86个蛋白点是不同感染组共有的差异点,包括52个感染后上调表达蛋白点,34个下调表达蛋白点;另外,有130个差异蛋白点为NDV感染鹅后不同毒株之间产生的差异表达,包括71个感染后上调表达蛋白点,59个下调表达蛋白点.基因Ⅳ型NDV强毒和基因Ⅶd亚型NDV强毒分别感染鹅后,能引起宿主脾脏组织蛋白表达谱发生不同的改变,这为进一步研究Ⅶd亚型NDV对水禽致病性增强的机制提供了重要线索....
摘要:为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9 K-b TAP.用Sal Ⅰ酶切线性化pPIC9 K-b TAP质粒后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导其表达.SDS-PAGE分析结果表明表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明表达的重组蛋白质bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果....
摘要:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组蛋白bTAP可在含2%酸水解酪蛋白的BMMY培养基中经0.5%甲醇在28℃诱导表达72 h后获得最优表达.抑菌试验表明bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果....
摘要:为比较鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒(NDV)与其它不同基因型NDV对鸽的致病性差异,本研究选取JS-7-05-Ch(基因Ⅲ型)、WX-10-07-Pi(基因Ⅵb型)、JS-5-05-Go(基因Ⅵd型)和F48E8(基因ⅠⅩ型)4个病毒株,分别人工感染2月龄实验鸽.接种后,观察实验鸽临床症状、病理剖解变化、同时检测Ⅲ抗体水平变化、喉气管和泄殖腔排毒以及病毒在组织分布情况.4株NDV均能导致接种鸽的发病,但死亡率分别为0、0、100%、50%.WX-10-07-Pi接种组鸽泄殖腔排毒时间最长、而且病毒检出率比其它组高.另外,在接种组鸽的多种组织器官中均可检测出病毒.实验结果表明,不同基因型NDV对鸽均有致病性,但致病力强弱与NDV毒株特性有关;基因Ⅳb型NDV在鸽体内可长期的带毒与排毒,与其它基因型NDV相比更易在鸽群中传播....
摘要:为了研究新城疫病毒(NDV)和宿主细胞之间的相互作用关系,本研究以NDV感染鸡胚成纤维细胞(CEF)为材料,对细胞培养方式、样品制备方法、上样量、等电聚焦以及凝胶染色等步骤进行一系列优化,建立了NDV感染CEF的双向凝胶电泳技术.运用PDQuest8.0.1软件对电泳图谱分析后显示:17 cm IPG胶条(pH 4~7)对应的凝胶上可检测到800个左右蛋白点、蛋白点匹配率达90%,表明NDV感染CEF蛋白质组双向凝胶电泳模型稳定、分辨率高、重复性好.电泳图谱上共发现36个差异表达明显的蛋白点,其中上调表达蛋白点有16个,下调表达蛋白点15个,新出现蛋白点3个,消失蛋白点为2个.NDV感染CEF双向凝胶电泳技术的建立为NDV的致病机理研究提供了有力的工具....
摘要:为研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的HN(血凝素-神经氨酸酶,hemagglutininneuraminidase)基因分子流行病学规律,利用RT-PCR扩增了2006~2008年间分离自我国华东地区的43株NDV的HN基因片段.基因序列分析显示,分离株中基因Ⅰ型2株,基因Ⅱ型3株,基因Ⅵ型1株,其它37株都属于基因Ⅶd亚型.根据遗传发生进化树可将基因Ⅶd亚型进一步分为Ⅶd1和Ⅶd 2两个亚型.基因Ⅶd 1亚型HN蛋白的第102、118、443位氨基酸分别为T,A和T,而基因Ⅶd 2亚型则分别为I,E和M.另外,研究表明HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:为了研究基因Ⅶ d亚型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分子流行病学及遗传变异规律,作者对2008年分离自江苏地区16株具有一定代表性NDV分离株的F和HN基因片段进行了扩增.根据F基因和HN基因序列绘制的2个遗传进化树基本一致,表明分离株中不存在囊膜糖蛋白基因发生重组的NDV;同时,HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势.基因Ⅶd亚型变异株的出现应引起相关领域从业者们的高度重视....
摘要:为分析2002~2007年Class Ⅰ新城疫病毒分离株NP基因的分子特征,以及其在新城疫病毒演化过程中所起的作用,采用RT-PCR方法扩增分离株的核衣壳蛋白(NP)基因,并进行了测序,应用生物信息学软件分析NDV NP基因的分子特征.根据NP基因序列的遗传发生分析表明,Class Ⅰ NDV 2型毒株与DE/R49-99和美国株亲缘关系较近,而3型毒株与其他Class Ⅰ毒株遗传关系较远,具有地区特色,形成一个独立的分支.生物信息学软件分析表明,NP蛋白N端1~400氨基酸比较保守,而C端序列(特别是氨基酸残基400~480)高度变异.ClaSs Ⅰ病毒2型毒株与国外分离株亲缘关系较近,可能有共同的起源;而3型毒株独立于其他Class Ⅰ毒株,具有独特性,这两种毒株的来源不同;不同基因型NP蛋白之间比较保守,但是P蛋白的C端发生了多个氨基酸的变异,对其功能的影响还需进一步探讨....
[期刊论文] 刘慧谋 吴培培 吴双
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA
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摘要:对从华东地区分离的6株鸡源H9N2亚型禽流感病毒进行了生物学特性及血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的分子遗传进化分析.发现这6株病毒对SPF鸡无致病性,IVPI均为0,可被单克隆抗体4E7分为2个亚群.序列分析表明,这6株病毒的HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,Ck/HD/16/07和Ck/HD/112/05的潜在糖基化位点与其他4株不一致;NA基因为N2亚型,其中4个毒株的茎部缺失3个氨基酸,而另2个毒株无缺失....
摘要:为分析2002~2007年分离的鸭源弱毒新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)磷蛋白(P)基因的分子特征,以及在新城疫病毒演化过程中所起的作用,采用RT-PCR方法扩增NDV弱毒分离株的P基因,进行测序,并应用生物信息学软件(SNAP和CODEML)研究了作用于NDV P基因的选择压力.根据P基因序列的遗传发生分析表明,NDV Ⅰ类(Class Ⅰ)2型毒株与德国鸭源毒株DE/R49-99和美国株亲缘关系较近,而3 b型毒株与其他Ⅰ类病毒遗传关系较远,具有地区特色,形成一个独特的分支;NDV Ⅱ类(Class Ⅱ)中基因Ⅰb型与中国广泛使用的基因Ⅰ型疫苗毒Qeensland V4(QV4)以及Ⅰ型代表株亲缘关系较远.生物信息学软件分析表明,P基因不同片段受到正选择压力的作用不一样,P基因的两端受到负选择压力的作用不易发生变异,而中间(aa 62~113和137198)片段多个位点受到正选择压力的作用.可见,Ⅰ类病毒中3 b具有地域特色,不同基因型P蛋白之间变异较大,而且P蛋白不同位置变异不均匀....
摘要:根据新城疫病毒M基因的保守序列,设计合成1对引物和TaqMan探针,以作者实验室构建并保存的鹅源新城疫病毒zJ1株M基因阳性重组质粒为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,结合ABI公司的7300型荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测新城疫病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法.该方法在106~101拷贝范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中3拷贝·μL-1的病毒核酸,与传统的病毒分离方法具有相近的敏感性,二者对500份临床禽泄殖腔棉拭样品检测结果阳性数、阴性数符合率分别为90.0%、99.8%.经临床应用表明:荧光定量PCR的建立为早期诊断禽新城疫病毒、定量分析禽新城疫病毒感染程度奠定了基础....
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