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[博士论文] 吴仕峰
外科学(骨外) 山东大学 2017(学位年度)
摘要:研究背景:
  急性脊髓损伤在临床上通常表现为发病急、危害大,具有治疗费用昂贵与转归预后不佳的特点,在脊柱外伤尤其是脊柱骨折患者中具有较高的发生率。自进入工业时代和交通业时代以来,脊髓损伤的发病率呈现出连续上升的势头。在医学发展的历史进程中,现代医学在诸多方面均取得了令人瞩目的成就,攻克了医学领域一系列的许多难题,但迄今为止,对脊髓损伤的治疗没有太多的临床手段和突破性的医疗技术,不论在脊髓损伤的治疗和并发症预防上都存在很大的短板,距离患者期望的完全治愈和彻底康复的良好愿景还相差甚远。脊髓损伤的病理过程是相当复杂的,涉及一系列的作用机理和基础理论。近几十年来,大量的实验研究者进行了无数的基础与临床实验研究,在基础研究和临床诊疗等方面做出了巨大的努力,目的就在于能够找到脊髓损伤发生后的明确机制,从而根据不同的原理分类采取针对性的措施进行治疗,最终来达到临床治愈的效果。
  脊髓损伤后的神经再生是目前生物医学领域研究的热点,同时也是临床一线医生所面临和被困扰的难点,脊髓损伤后必将出现原发性损伤和继发性损伤并存的现状。针对上述两种损伤的神经功能修复主要存在两大难点,第一,如何替代脊髓损伤区域变性坏死的神经元,恢复原有的神经元数量。第二,如何预防和抑制损伤区域疤痕的形成,提供一个适宜神经元再生的微环境。
  近二十年来,经过广大研究者的不懈努力,脊髓损伤的修复再生研究取得了较大的进展,目前研究最多的就是种子细胞移植,也是已经尝试应用于临床治疗的措施手段。嗅鞘细胞同时具有星形细胞和许旺氏细胞的特性,能够穿行于外周神经和中枢神经,具有促进神经元轴突再生和神经元再髓鞘化的作用。在大量的实验研究和部分临床治疗中均证实嗅鞘细胞具有一定程度修复脊髓损伤的作用,也是目前脊髓损伤实验研究最多的种子细胞之一。
  嗅鞘细胞之所以能够成为目前最佳的移植细胞是与其自身独特的生物学特性密不可分的。嗅鞘细胞可以生成和分泌脑源性神经生长因子、骨形态发生蛋白、神经细胞粘附因子、层粘连蛋白、血小板源性生长因子和低亲和力神经生长因子受体等。嗅鞘细胞通过上述生物学特性在修复脊髓时具有改善受损区域脊髓内部微环境,抑制有害因子产生,减少局部炎症反应的作用。同时嗅鞘细胞启动髓鞘形成和轴突再生的修复程序,引导受损神经轴突修复再生,重新建立神经联系,恢复原有的神经功能。此外,嗅鞘细胞还可以通过抑制胶质细胞的增生,减少损伤处瘢痕的形成,阻碍脊髓内部空洞的出现,为脊髓损伤的修复和重建提供基础,从而有利于新生轴突重新穿越损伤区域,建立神经传导的途径,恢复原有的神经功能。
  脊髓损伤的康复治疗与患者的康复效果和预后密切相关,早期临床康复介入治疗是提高脊髓损伤患者预后的一个重要临床治疗手段。合理的物理治疗措施会显著提高患者的脊髓功能恢复程度,是提升脊髓损伤临床功能分级水平的治疗方法,并且已经得到研究证实。物理治疗根据种类的不同,其各自的治疗效果和临床用途也各不相同,物理治疗的共同效果主要表现为加快局部血液循环,改善局部条件,减少炎症因子释放,起到减轻组织水肿,减轻炎症反应,缓解疼痛的效果。除此以外。每种物理治疗还具有自身各自独特的作用,比如可以引起肌肉收缩,体液电离和极化,局部温度升高等。在目前的物理治疗中电刺激具有改善局部微循环,促进神经营养因子表达和促进移植细胞存活等作用。因此,在损伤初期通过电刺激治疗可以实现减轻脊髓损伤的继发性损害,利于神经元的存活和神经轴突的生长,在后期则可以减少脊髓损伤并发症的发生,提高患者生存率和生活质量,降低临床的致残率与死亡率。借助物理治疗的手段来治疗脊髓损伤在康复医学领域是预防和治疗继发性损伤所采取的最早措施,通过电疗和电刺激来改善损伤局部微环境的变化,加速神经元的修复,改善中枢神经的功能恢复。
  脊髓损伤的修复机制是错综复杂的,修复所需的干预措施也涉及许多方面,单一的治疗手段肯定不是最佳的选择,采用适当的联合手段发挥协同作用来提高修复效果,对修复脊髓损伤来讲更具有必要性,因此本实验应用嗅鞘细胞移植联合物理治疗修复脊髓损伤,探讨不同治疗方式的修复效果,观察损伤区域神经元的凋亡情况。
  目的:
  1、探讨能够满足脊髓损伤实验研究所需动物模型的制备。
  2、选择合适的嗅鞘细胞制备方法,确保满足移植所需的嗅鞘细胞。
  3、探讨物理治疗对脊髓损伤的修复作用。
  4、探讨嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的修复作用。
  5、探讨嗅鞘细胞联合物理治疗对脊髓损伤的修复作用,观察嗅鞘细胞和物理治疗的在治疗过程中的协同效果。
  方法:
  1、应用虹膜刀予以彻底离断大鼠脊髓,离断水平在胸10部位,制备完全离断的脊髓损伤动物模型。
  2、对培养的嗅鞘细胞在移植前采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法联合纯化,观察细胞的纯度。
  3、对原代培养的嗅鞘细胞和传代培养的细胞固定后进行p75免疫荧光染色,在荧光显微镜下观察对细胞进行鉴定。
  4、将60只成年S-D大鼠模型随机分为四组,分别为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、嗅鞘细胞联合物理治疗组和对照组。
  5、在动物造模后次日,每日给予低频直流电刺激,每次作用15分钟,每日进行两次,观察物理治疗的修复效果。
  6、在动物造模后1周,脊髓损伤处及其远近端分别用微量注射器注射移植细胞,观察细胞移植后的脊髓功能的改善情况。
  7、在细胞移植和物理治疗后分别通过BBB功能评分、H-E染色、嗜银染色、辣根过氧化物酶染色、体感诱发电位等方法观察脊髓损伤的修复程度。借助免疫荧光染色、Western-blot免疫印迹和Tunel染色来进一步观察损伤区域移植细胞存活和脊髓神经细胞凋亡的情况。
  结果:
  1、采用脊髓离断法造模既能保证实验动物的存活率,也能达到模拟临床的效果,符合脊髓完全离断的标准,可以作为脊髓损伤动物模型的制备方法。
  2、采用改良Nash差速贴壁法和阿糖胞苷化学抑制法纯化的细胞纯度可达95%,符合细胞移植的要求。
  3、原代培养和传代培养的嗅鞘细胞p75免疫荧光鉴定均为阳性,细胞的生物学性质没有变化。
  4、在细胞移植和物理治疗后,各组实验动物的BBB功能评分根据得分高低最高为嗅鞘细胞联合物理治疗组,其余依次为嗅鞘细胞移植组、物理治疗组、对照组,各组间数值均具有统计学意义(p<0.05)。H-E染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组脊髓结构较其余各组清晰,神经纤维更具有方向性,存在散在分布的大小不一的空洞,其余各组均显示脊髓黑白质界限不清,结构紊乱,神经纤维中断扭曲,走行没有方向性,损伤区域存在大量的脊髓空洞。嗜银染色结果表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经纤维数量最多,与其余各组相比具有统计学差异(p<0.05)。对照组神经纤维数量极少,走向毫无方向性,神经纤维全部中断,没有连续性。辣根过氧化物酶染色显示鞘细胞联合物理治疗组神经元的数目最多,多于其他各组,结果具有统计学意义(p<0.05),嗅鞘细胞组、物理治疗组和对照组组间也具有统计学差异(p<0.05)。诱发电位检测表明各组动物在细胞移植后1周时均可检测到波形,嗅鞘细胞联合物理治疗组的诱发电位潜伏期低于其他各组。在移植后2周时,各组检测的潜伏期无明显统计学差异。在移植后4周时,嗅鞘细胞联合物理治疗组的潜伏期最短,与其他各组相比结果具有统计学差异(p<0.05)。在细胞移植后6周和8周时,各组的潜伏期由短至长依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间比较均具有统计学意义(p<0.05)。各组动物在细胞移植后1周时开始出现波形,可以检测到波幅,在移植后2周时各组动物检测到的波幅均较小,各组间比较没有差异。在移植后4周时嗅鞘细胞联合物理治疗组动物波形的波幅最高,超出其余各组波幅,差异具有统计学意义(p<0.05),在移植后6周和8周时各组的波幅继续升高,由高到低依次为嗅鞘细胞联合物理治疗组、嗅鞘细胞移植组和物理治疗组、对照组,各组间波幅差异具有统计学意义(p<0.05)。
  5、免疫荧光染色显示嗅鞘细胞联合物理治疗组和嗅鞘细胞移植组均有嗅鞘细胞在体内存活,但前者的细胞数量多于后者,二者相比具有统计学意义(p<0.05)。Western-blot免疫印迹检测显示Bax、Bcl-2和Caspase-3、Caspase-9蛋白表达结果为:嗅鞘细胞联合物理治疗组Bcl-2蛋白明显升高(p<0.05),caspase-9和caspase-3的表达减少(p<0.05),而Bax均变化不大。Tunel染色表明嗅鞘细胞联合物理治疗组神经元细胞凋亡的数量最少,具有统计学意义(p<0.05)。
  结论:
  1、完全离断脊髓损伤动物模型制备简单,重复性高,效果可靠,适宜用来进行脊髓损伤动物实验研究。
  2、实验制备获取的嗅鞘细胞的纯度、数量及生物学特性能够满足移植需要,可以做为修复脊髓损伤的种子细胞。
  3、嗅鞘细胞移植和物理治疗均具有一定程度的脊髓损伤修复作用,并且嗅鞘细胞移植联合物理治疗的修复效果最好,功能改善程度最高,优于单一手段的修复作用,但是远未达到完全修复的程度。
  4、嗅鞘细胞移植联合物理治疗能够最大程度的减少神经元的凋亡,继而保留损伤区域的脊髓功能。
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