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[硕士论文] 吕甲强
生物学 曲阜师范大学 2016(学位年度)
摘要:黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)俗称小腮鼠、背纹仓鼠、花背仓鼠等,是我国北方农田害鼠的优势种,分布范围广,繁殖能力强,危害性大。黑线仓鼠的繁殖活动具有季节性节律,属于季节性繁殖动物,每年春、秋季为繁殖高峰期,研究黑线仓鼠的季节性繁殖机制能够探究外在环境信息调控黑线仓鼠繁殖活动的信号通路,可以探寻从生物学角度消灭鼠害的方法。KiSS-1/GPR54系统是季节性繁殖调控体系中非常重要的一环,在黑线仓鼠中发现:KiSS-1的mRNA表达量和kisspeptin含量都存在季节性差异,都是冬季的表达最低,夏秋表达比较高;而且KiSS-1的mRNA表达量与光照长度成正比;褪黑激素对KiSS-1的表达具有抑制作用。本实验从启动子DNA甲基化入手研究KiSS-1的表达模式,以探究KiSS-1基因参与黑线仓鼠季节性繁殖调控的分子机制。
  首先我们利用黑线仓鼠的肝脏组织,通过PCR扩增、克隆测序获得KiSS-1基因启动子序列,并对此序列进行生物信息学分析,鉴定其核心启动子并预测CpG岛为检测其甲基化状态打下基础。此序列全长2012bp,GenBank登录号:KU965557,将此序列与黑线仓鼠编码序列相比对,找到翻译起始密码子,起始密码子前有序列1997bp,剩余的12bp序列为KiSS-1基因的编码序列。此序列GC含量为52.3%,高于AT含量。发现转录起始位点位于起始密码子上游500bp处,并发现启动子核心区TATA框,位于转录起始位点上游-22bp处,并且在TATA框上游发现顺式作用元件CAAT框位于转录起始位点上游-227bp处。将启动子序列以及附近编码序列导入MethPrimer预测到CpG岛,全长420bp,GC含量为58.6%,远高于AT含量,含有11个CpG位点。
  选取4个季节的雌性黑线仓鼠的下丘脑,我们每个季节选取3只雌性黑线仓鼠的下丘脑组织,提取基因组DNA,然后利用亚硫酸盐测序法检测KiSS-1基因启动子CpG岛甲基化状态,每个个体筛选10个克隆。利用biq2.0分析测序结果做出点状图,通过分析点状图可以发现:11个CpG位点中只有第2个位点是全部非甲基化状态;第5个CpG位点只有夏季是非甲基化的,其他季节是甲基化状态的。可以推测第二个位点与可能KiSS-1基因表达有关;夏季KiSS-1基因表达最高可能与第五个位点有关。根据点状图计算出四个季节的黑线仓鼠的甲基化状态分别为:81.82%,76.67%,84.85%,89.70%,单因素方差分析发现冬季的甲基化程度最高,春季和秋季的甲基化程度居中,显著低于冬季的甲基化程度,而夏季的甲基化程度最低。将其与黑线仓鼠四个季节KiSS-1的mRNA表达量进行相关性分析,结果表明黑线仓鼠KiSS-1 mRNA表达量与KiSS-1启动子甲基化状况呈中度负相关(r=-0.781,p=0.003)。即甲基化程度越高,mRNA表达量越低,可以推测启动子甲基化抑制基因表达。将KiSS-1启动子甲基化状态与四个季节的光照周期比较,发现两者的变化趋势相反,即光照时间越长,甲基化程度越低,推测光照长度与启动子甲基化程度呈负相关。而光信号会影响褪黑激素的释放,而褪黑激素也抑制KiSS-1基因的表达,所以推测光信号影响KiSS-1是通过褪黑激素影响KiSS-1启动子甲基化程度来完成的。光照时间增多会抑制褪黑激素的分泌,褪黑激素含量降低会通过一定途径导致KiSS-1启动子甲基化程度降低,会使KiSS-1基因的表达增强,促进kisspeptin合成,促进GPR54表达,GPR54会促进GnRH神经元合成和释放GnRH,进一步促进LH和FSH的释放,促进繁殖。
  综上所述,本研究通过自然季节取样和亚硫酸氢盐测序法相结合,研究了KiSS-1启动子甲基化在KiSS-1/GPR54系统中的作用,进一步揭示了KiSS-1/GPR54系统在季节性繁殖调控中所起的作用,为进一步深入的研究季节性繁殖的调控机制和生物防治鼠害提供了科学的理论依据。
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