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[硕士论文] 司猛
神经病学 苏州大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  1.研究G蛋白抑制性亚基Gαi1与Gαi3在睫状神经生长因子(Ciliary nerve growth factor,CNTF)激活Akt-mTORC1通路与增加Gab1、Erk、GSK-3β磷酸化水平过程中的作用。
  2.Gαi1与Gαi3在鱼藤酮(rotenone)与6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-Hydroxydopamine hydrobromide,6-OHDA)所致细胞损伤过程中的作用及机制。
  方法:
  以野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEFs)、Gαi1与Gαi3双敲除MEFs(DKO MEFs)、单一敲除Gαi1、Gαi3或Gαi2的MEFs(Gαi1-KO MEFs、Gαi3-KO MEFs、Gαi2-KO MEFs)、敲除Gab1的MEFs细胞(Gab1-KO MEFs)为工具细胞,CNTF为工具药物,用CNTF分别处理上述MEFs细胞,应用Western Blotting检测pGab1(627Y)、Gab1、Akt1/2/3、pAkt(473S)、pAkt(308T)、pErk1/2、Erk1/2、pGSK-3β(9S)、GSK-3β、pmTOR、mTOR、pS6K(389T)、pS6(235/236S)等蛋白的含量。通过慢病毒构建Gαi1与Gαi3 shRNA载体干扰MEFs中Gαi1与Gαi3的表达,或通过将Gαi1与Gαi3基因序列重新导入DKO-MEFs中,恢复细胞中Gαi1与Gαi3的表达,应用Western blotting进一步验证Gαi1与Gαi3在CNTF激活Akt-mTORC1通路及pErk1/2、Gab1蛋白及磷酸化抑制 pGSK-3β(9S)作用。应用鱼藤酮及 CNTF对SK-N-SH进行处理,MTT法检测细胞活性。以慢病毒作为载体通过 shRNA干扰SK-N-SH细胞内Gαi1或Gαi3的表达,然后再用鱼藤酮及CNTF对其进行处理,MTT实验检测CNTF与鱼藤酮处理后细胞活性,应用Western blotting检测相关信号蛋白的改变,进一步研究Gαi1与Gαi3在CNTF对鱼藤酮损伤细胞中的保护作用的机制。鱼藤酮或6-OHDA处理WT MEFs,DKO MEFs后,通过MTT检测两种细胞活性, Western Blotting检测P38、JNK、AMPK等信号蛋白的活化水平。
  结果:
  1. Gαi1与Gαi3基因同时敲除后CNTF诱导的pGab(627Y)、pAkt(473S)、pAkt(308T)、pErk1/2、pGSK-3β(9S)、pmTOR、pS6K(389T)、pS6(235/236S)的水平显著降低(p<0.05)。
  2.单一敲除Gαi1、Gαi3基因会在一定程度上抑制CNTF对Akt-mTORC1通路信号蛋白的活化及Erk、Gab1、GSK-3β磷酸化水平,其中以Gαi3蛋白的缺失对该通路激活作用影响较明显,而单一敲除Gαi2基因未产生上述现象(p<0.05)。
  3.Gab1基因敲除后,抑制了CNTF诱导的pAkt(473S)、pAkt(308T)、pErk1/2、pGSK-3β(9S)、pS6K(389T)、pS6(235/236S)磷酸化水平的升高(p<0.05)。
  4.CNTF对鱼藤酮所致的细胞损伤有一定的保护作用(p<0.05)。
  5.同时缺失Gαi1与Gαi3蛋白的MEFs可减轻鱼藤酮对其损伤作用,鱼藤酮对该细胞中p38、 JNK、AMPK信号通路的活化作用减弱(p<0.05)。
  结论:
  Gαi1、Gαi3及Gab1在CNTF激活Akt-mTORC1通路及Erk、GSK-3β的磷酸化过程中具有重要作用,且Gab1位于Gαi蛋白下游,Akt信号蛋白上游。细胞内Gαi1与 Gαi3蛋白的缺失可减轻鱼藤酮和6-OHDA对细胞的损伤作用,机制可能为 Gαi1与Gαi3的缺失减弱了鱼藤酮和6-OHDA对细胞内P38、JNK、AMPK活化作用。
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