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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx23'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于miRNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA,参照已克隆出来的emx2基因cDNA序列,设计并合成emx23'UTR片段的引物并进行 PCR扩增,将得到的基因片段和 psiCHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入 DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx23'UTR区,并将emx23'UTR区的miRNA靶点序列GACTTGA突变为 AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx23'UTR区的miRNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于miRNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3'UTR和 psiCHECK-mutated-emx2-3'UTR。...
摘要:miRNAs 通过与靶mRNA 结合调节特定基因的表达进而参与众多生物学过程的调控。我们先前的miRNA 高通量测序结果显示pol-miR-26a 和pol-miR-26b 在牙鲆精卵巢中有明显的差异表达,生物信息学预测表明空通气孔同源框2 基因(empty spiracles homeobox2,emx2)是pol-miR-26a,26b 作用的潜在靶基因,且该基因在生殖医学领域的研究逐步受到重视。
[硕士论文] 印翠
生物学 上海海洋大学 2015(学位年度)
摘要:牙鲆(Paralichthys olivaceus)作为珍贵的温带海洋性物种之一,由于其蛋白质含量较高,个体大,脂满味美且极易消化,具有很高的营养和经济价值,已经成为我国重要的海洋鱼类养殖品种。人工养殖中,雌鱼2年龄性腺发育成熟,雄鱼1年龄性腺就已发育完成,但鉴于雄鱼用于精巢发育所消耗的能量要比同时期还未性成熟的雌鱼多的多,加之性成熟后牙鲆雄鱼有近5个月的繁殖期,摄取的营养大多用于繁殖,在人工培育过程中雌鱼个体要明显大于雄鱼,所以通过性别控制来增加养殖产量成为重要的研究内容。因而相关的性别决定及性腺发育分子机制的研究也备受重视。
  牙鲆中已有不少关于性腺发育和分化相关基因的鉴定和功能分析报道,但此类基因的挖掘多集中于这些编码基因的表达规律和功能分析,对其转录后水平调控尤其是microRNA(miRNA)的研究鲜有报道。本实验室先前已建立了牙鲆精卵巢miRNA文库,并通过第二代测序(NGS)技术和生物信息学方法鉴定了141个成熟miRNA,筛选出一批在牙鲆雌雄性腺中差异或特异表达的miRNA。
  在此基础上,本研究首先挑选了2个表达量较高且在精卵巢中显著差异表达的miRNA(pol-miR-26a,26b),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和原位杂交进行pol-miR-26a,26b在牙鲆性腺中的表达分析,结果表明:pol-miR-26a,26b在牙鲆成鱼的精巢中表达量相对最高,在牙鲆脑组织中也有较高的表达,但在卵巢中两者的表达量均显示相对较低。原位杂交定位显示:pol-miR-26a,26b蓝紫色阳性信号明显成片状分布且多集中在成熟的精子细胞中分布在小叶腔内;而在成鱼卵巢中pol-miR-26a,26b基因的阳性信号成稀少的片状分布,表达主要集中在V时相的卵母细胞及其细胞边缘的滤泡膜上。这些结果表明pol-miR-26a,26b可能在牙鲆性腺的发育中发挥重要作用。
  miRNA靶标的检测是研究miRNA功能的重要环节。本实验利用TargetScan、PicTar和miRBase等靶基因预测软件预测出pol-miR-26a,26b有多个靶mRNA,挑选出了其中和鱼类性别决定和性腺分化相关的empty spiracles homeobox2(emx2)基因,并进行了emx2基因鉴定和表达研究,该基因cDNA长1665bp,包含一段编码246个氨基酸残基的741bp的开放阅读框(ORF),一段12bp的5’-UTR区和一段912bp的3’-UTR区(GenBank accession number:KP260631)。氨基酸序列比对结果表明牙鲆 Emx2与其他物种具有71-98%的高度同源性,且具有高度保守的emx2的经典同源框序列。Neighbor-Joining法(bootstrap1000)构建的系统进化树表明牙鲆Emx2与硬骨鱼类同属于鲽形目的半滑舌鳎的Emx2聚为紧密的一支。不同组织和早期不同发育时期的定量PCR结果显示:牙鲆emx2基因在成鱼性腺中有很高的表达水平,且在卵巢中具有比精巢相对较高的表达水平,此外在脑组织中也有较高的表达。而在牙鲆胚胎早期发育阶段,牙鲆emx2基因在神经胚时期相对表达量最高。而在随后早期的胚胎发育和仔鱼生长时期emx2 mRNA的相对表达量逐渐降低。对比emx2基因和pol-miR-26a,26b在牙鲆雌雄性腺中的表达,发现二者在牙鲆精卵巢的表达趋势恰好相反,这也暗示了emx2基因很可能是pol-miR-26a,26b潜在的靶基因。
  为了进一步验证emx2基因是否为pol-miR-26a,26b的靶基因,最后成功克隆了牙鲆emx23’-UTR区,对其与pol-miR-26a,26b的结合位点进行了定点突变将GACTTGA突变为 AGTCCAG,并构建了野生型和突变型的靶标报告载体;采用DLR双荧光素酶检测系统验证emx2基因与pol-miR-26a,26b结合位点是否预测正确。结果表明:pol-miR-26a,26b与野生型质粒psiCHECK-emx2-3’UTR共转染后,与空白组和阴性对照组共转染相比较,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)活性明显降低,证明pol-miR-26a,26b的“种子序列”与emx23’UTR的结合从而切割降解靶基因。pol-miR-26a,26b inhibitor与野生型质粒psiCHECK-emx2-3’UTR共转染后,pol-miR-26a,26b inhibitor海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值与blank、NC inhibitor比较P>0.05无统计学差异。表明细胞内源性pol-miR-26a,26b表达量没有达到能阻碍其与emx2基因3’UTR结合而影响其荧光活性改变。而突变型质粒psiCHECK-mutated emx2-3’UTR与pol-miR-26a,26b共转染后,海肾荧光素酶(RL)/萤火虫荧光素酶(FL)比值较之空白组和对照组均无显著性差异。从而证明由于位点的突变,pol-miR-26a,26b缺失与emx23’UTR的结合能力从而无法发挥对靶基因的切割降解作用。因此,双荧光素酶报告实验表明牙鲆emx2基因是pol-miR-26a,26b直接作用的靶基因,并为pol-miR-26a,26b在牙鲆性腺发育中的调控提供了分子证据。
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