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摘要:[目的]为了获得高产漆酶的菌株用于降解木质素.[方法]从新乡周边腐木堆积处、秸秆堆积处和造纸厂废水这些木质素含量丰富的地方取样,以木质素为唯一碳源,初筛出对木质素具有降解能力的菌株.[结果]采用愈创木酚平板法对产漆酶的菌株进行复筛得到4株产漆酶能力较强的菌株,通过生理生化及18S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,通过液态发酵培养以2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)(简称ABTS)法对漆酶活性和木质素降解能力进行研究.结果表明,黄孢原毛平革菌在培养6 d后,漆酶活力达到最高,为233.33 U/L.利用液态发酵研究了碳源、氮源、金属离子、pH、温度对其发酵产漆酶的影响,确定了该菌株的最优碳源为乳糖,最优氮源为酵母粉,最适铜离子浓度为0.6 mmol/L,最适温度为30℃,最适pH为4,在此条件下木质素去除率达到了84.7%.[结论]试验筛选出的黄孢原毛平革菌具有良好的降解木质素的能力,为研究漆酶基因的克隆表达和酶学研究奠定了基础....
[期刊论文] 陈建军 刘梁涛 曹香林
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CSTPCD 北大核心
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摘要:以先前筛选到的高产漆酶黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1680 bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为lac1680,将该基因连接到构建好的pET24a载体上,并转入表达菌株BL21 Escherichia coli(DE3)中,经对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE检测,获得75 kD目的条带,表明诱导表达成功.随后利用NI-NTA层析柱对洗脱下来的lac1680蛋白进行纯化,纯化回收后,漆酶纯度可达98% 以上.通过对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌野生菌株不同培养时间产酶活力,结果表明构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39%....
[专利] 发明专利 CN201711438337.0
河南师范大学 2018-07-06
摘要:本发明公开了一种快速鉴定鱼类出血病的分子生物学方法,属于分子生物学技术领域。本发明的技术方案要点为:通过病鱼尾部静脉取血提取待测病原菌基因组DNA;以待测病原菌基因组DNA为模板,利用3对特异性引物对进行PCR扩增反应;琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,若3对特异性引物对均得到扩增条带,则为气单胞菌感染导致鱼类爆发性出血病。本发明提供的气单胞菌毒力基因特异引物能够快速准确地识别出病鱼的病原菌类别,该发明操作简单,无需太多的精密仪器,完全适合在常规条件下进行检测,且可重复性强。
[专利] 发明专利 CN201810037232.2
河南师范大学 2018-05-11
摘要:本发明公开了一种黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体及重组产漆酶工程菌的构建方法,以黄孢原毛平革菌为模板,利用同源克隆技术合成一个全长为1680bp的漆酶基因,核苷酸及氨基酸序列比对显示该漆酶基因与真菌漆酶基因有较高的同源性,将其命名为漆酶基因lac1680;根据漆酶基因lac1680的基因序列以及表达载体PET24a的MCS位点,将胶回收漆酶基因片段连接到经相同酶切线性化的表达载体上得到黄孢原毛平革菌漆酶基因的重组质粒载体,连接后的含有重组质粒载体的连接液转化大肠杆菌E.coli BL21,挑取阳性转化子,提取质粒酶切鉴定后测序,最终得到重组产漆酶工程菌。本发明构建的重组基因工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了近39%。
[硕士论文] 刘梁涛
生物学、微生物学 河南师范大学 2018(学位年度)
摘要:木质素是一种高分子的聚合物,在自然界中的含量仅仅低于纤维素,作为苯丙烷的基本结构单元,其连接形式通过C-C键和C-O-C键相互连接,从而构成无规则的空间三维结构,因而在自然存在的状态下难以被降解。目前在利用微生物降解的同时,也使得能产生大量的降解木质素的酶对木质素进行分解转化,不单单可以治理环境污染的问题,而且可以合理利用自然界中的木质素资源。
  因此,利用合理的方法分离纯化木质素降解菌,探索产酶能力及发酵条件,构建高效表达漆酶基因工程菌并应用于生产实践显得尤为重要,这将大大加快木质素原料在工农业生产的利用步伐,同时也是制约环境污染的关键所在。
  试验一高产漆酶菌株的筛选及鉴定
  为了获得高产漆酶的菌株用于降解木质素,分别从新乡周边腐木堆积处、秸秆堆积处和造纸厂废水这些木质素含量丰富的地方取样。本研究以木质素为唯一碳源,初筛出42株对木质素具有降解能力的菌株,采用愈创木酚平板法对产漆酶的菌株进行复筛得到4株产漆酶能力较强的真菌菌株,通过生理生化及18SrDNA序列分析对菌株进行鉴定,确定了2号菌株为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),6号菌株为粗毛革孔菌(Coriolopsis gallica),8号菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium),11号菌株为白腐菌(White rot fungi)。并通过液态发酵培养及ABTS法对漆酶活性木质素降解能力进行研究。
  试验二目的菌株产酶能力的比较及发酵条件的探索研究
  挑取筛选出来的四种真菌菌株于液体培养基中,制备粗酶液,并利用ABTS法每天测定上清液中的酶活力。试验表明,在经过培养6天后,8号菌株漆酶活力达到最高,为233.33U/L。接下来以黄孢原毛平革菌为目的菌株为研究对象,利用液态发酵研究碳源、氮源、金属离子、pH、温度对其发酵产漆酶的影响,优化产酶条件。结果表明:该菌株的最优碳源为乳糖,最优氮源为酵母粉,最适铜离子浓度为0.6mmol/L,最适温度为30℃,最适pH为4。在此条件下木质素去除率达到了84.7%,具有良好的降解木质素的能力,为进一步利用此菌株进行工业化生产奠定了基础。
  试验三黄孢原毛平革菌漆酶基因的克隆表达及蛋白的纯化
  为了获得高产漆酶的工程菌株,根据目前已知的黄孢原毛平革菌中的漆酶基因序列,设计特异性的引物,通过PCR扩增,可以成功的获得cds区为1680bp片段,送生工测序后对比发现此基因的序列与目前已公布的漆酶基因片段的同源性达98%,这就表明我们成功克隆到了该基因,将其命名为lac1680。在漆酶基因两段引入NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切,将切下来的漆酶基因,通过pET-24a载体进行连接转化到大肠杆菌原核菌株中,得到基因工程菌。将我们得到的漆酶的氨基酸序列和GeneBank中现有的真菌漆酶氨基酸序列对比分析表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的序列同源性;通过对重组菌预表达的全菌裂解物进行SDS-PAGE,出现75KDa目的条带,表明诱导表达成功;预表达成功后,通过收菌,破碎,上样流出液进行NI-NTA的层析柱,对纯化洗脱下来的mcol-c-His6蛋白进行纯化;为了更进一步的验证这个条带就是所需的漆酶条带,我们通过WesternBlot方法,洗脱纯化后和浓缩后的溶液中在目的位置都出现了75KDa的目的条带,证明这个条带就是诱导纯化后的漆酶。并经纯化回收后,漆酶纯度在98%以上。通过酶学性质的探究,对比基因工程菌和黄孢原毛平革菌培养不同时间酶活力的比较,构建好的工程菌活力比原菌酶活力有明显的提高,提高了39%,为进一步利用工程菌株进行工业化生产奠定了基础,也为以后的应用指明了方向。
摘要:棉酚是存在于棉籽粕中对动物有害的一种物质,因此若将棉籽粕作为动物饲料蛋白源,其利用率会大幅降低(不足30%).通过生物降解的方法去除有害物质,成为提高棉籽粕利用率的有效手段.首先研究以醋酸棉酚为唯一碳源,分别从河南省新乡市周边不同的棉田和棉花榨油厂等土壤地取样,初筛48株对棉酚具有降解能力的菌株,通过复筛得到6株降解棉酚能力较强的菌株,然后对其进行菌株形态学观察及18S rDNA分子鉴定,结果发现:6株菌分别是黑曲霉、黄曲霉、产紫青霉、土曲霉、青霉及酿酒酵母;利用间苯三酚法对6株菌的棉酚降解能力进行比较,结果发现土曲霉的降解能力明显优于其他菌株,其纯棉酚降解率达33.6%.最终以土曲霉为发酵菌株,棉粕为发酵底物,进行固态发酵;结果在料水比1.0∶0.6(g/mL),接种量6%,蛋白胨3%,麦芽糖10%,30 ℃恒温培养72 h的条件下,土曲霉菌株脱毒效率最好可达88.3%.该菌株的获得和鉴定,能为其在饲料工业化生产中的应用奠定基础....
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