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[硕士论文] 刘志祥
基础兽医学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:大脑作为人体最为复杂、精密的器官,由数百亿个神经元构成。单个神经元通过突触结构与其他神经元连接并形成具有功能的神经网络,从而赋予动物个体意识与行为。基于组织样本投入的传统建库测序技术会掩盖神经元彼此间存在的异质性,不适用于单神经元研究,同时,不同神经元的形态、功能以及基因表达存在的差异性由表观遗传因素所决定。因此研究提出了一种对单神经元示踪标记及其细胞核分离的研究方法,并选取表观遗传的重要形式——DNA甲基化作为研究对象。
  在对重组腺相关病毒(rAAV)的构建工作中,本课题首先构建了表达目的核膜蛋白的腺相关病毒重组载体pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag,分别用广谱启动子CMV和神经元特异性启动子hSyn在细胞系转染实验体外表达和鼠脑神经元活体表达表达目的核膜蛋白。构建载体被转染进HEK-293T细胞以进行验证,转染后的细胞通过荧光显微镜观察,可见荧光信号呈圆形分布、边缘更加明亮,说明目的核膜蛋白如预期实现核膜定位标记。但通过病毒鼠脑注射实验对所包装重组病毒载体进行验证,未能在脑切片上观察到荧光信号。由于可能存在因启动子差异或是实验操作因素造成阴性结果的可能,本研究也构建包装了腺相关病毒重组载体rAAV-hSyn-eGFP-NLS,并对其进行活体注射,在脑切片可观察到大量被荧光标记的神经元,成功实现对海马投射内嗅皮层神经元的逆向标记,从而排除上述可能性。
  在分离被标记细胞核的研究过程中,本课题通过细胞转染的方式模拟被重组病毒标记的神经元。研究过程中,首先对转染后的细胞进行匀浆处理及密度梯度离心,以分离细胞核。分离到的细胞核形态完整且杂质较少。之后通过免疫共沉淀的方式对被标记细胞核细胞核进行捕获,所捕获细胞核阳性率约为70%,捕获率在65%~85%。同时对照组阴性细胞核漂洗后的残留率仅为0.18%,因此可认为实验组中阴性细胞核已基本漂洗干净,该实验方法可己满足后续研究需求。
  在利用单细胞进行DNA甲基化测序建库的研究过程中,本课题参照单细胞亚硫酸盐测序(scBS-seq)的方法,先后分别以寡量细胞及单个神经元作为建库投入,成功获得DNA甲基化测序建库。所建文库经琼脂糖凝胶电泳检测,文库片段分布大小与预期相符(300bp~500bp),同时条带明亮,满足上机测序要求。同时对测试样本的测序结果进行生物信息学分析,发现文库测序质量较好,且组间因建库操作造成的差异较小,因此认为该方法具有较好的可重复性。
  针对本课题所遇到AAV载体装载容量受限的问题,本文最后还对如何现有提高AAV装载容量的研究进行论述,并提出对衣壳蛋白编码基因cap进行人工进化的改进的新思路。此外也单细胞DNA甲基化测序技术在医学检测中的应用进行论述。
[成果] 1200330104 湖北
[TS212, TS210.4] 应用技术 方便食品制造 公布年份:2012
成果简介:该项目属于食品科学技术领域,针对工业化程度低、生产规模小、质量难以控制、加工技术落后、消费区域狭窄等制约米制品产业发展的瓶颈问题,重点推广高新技术在产业链中应用,解决了多项行业难题。1.主要内容及特点:(1)专用稻品种筛选和保优栽培:集成主成分分析、聚类分析和回归分析等方法,筛选出米粉(线)、米饼、米发糕等传统米制品的加工型优质专用稻品种12种,培育出高GABA稻米品种,GABA含量提高约3倍。集成适宜施肥、农机耕作、生态防治等技术生产优质专用稻,实现亩均增产约150斤。(2)传统米制品现代加工:集成超微粉碎、质地调理和气流干燥等技术开发米制品专用粉,保质期6个月以上,缩短加工时间5-10h。集成适度老化、真空揉搓、高温高湿干燥、滚动糊化、膨化等技术开发方便米制品,淀粉消化率90%以上。集成优良菌种选配、高速离心和微波干燥等技术生产专用发酵剂,微生物存活率达50%以上。集成质地调理和营养配伍等技术开发发酵米制品,发酵速度提高80%。集成气调包装、速冻、冰点调节等技术开发冷藏类米制品,保质期1年以上。集成体外矿物质激活酶类、目标营养素控制等技术开发高GABA发芽米制品。采用干法变性技术开发变性淀粉(取代度提高5%-12%)、品质改良剂(提高食品乳化性和保水性、减缓老化)等。(3)米制品质量保障体系:首创微波在线杀虫防霉储藏技术,害虫致死率达100%,霉菌和酶活抑制率80%以上。集成SSR、PCR、无损在线检测、冷链和HACCP、质量溯源体系等构建产业链的质量安全保障体系。2.应用推广:研发20余种现代化改造米制品,通过10项成果鉴定,申请专利71项,授权26项,软件著作登记权1项,发表论文210篇,其中SCI/EI收录58篇。技术成果先后在10多家企业推广应用,累计新增产值¥119.28亿元,利税¥17.25亿元,创汇$1277.6万美元,节支¥13.69亿元,社会经济效益显著。
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