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[硕士论文] 刘奎升
生物学;生物化学与分子生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:哺乳动物的发育起始于精子(sperm)与卵子(oocyte)的结合,两者形成受精卵(zygote)后启动发育程序,此后受精卵会经历一系列的卵裂(cleavage),细胞数量不断增多,细胞功能形态差异化。1981年由Evans和Kaufman从小鼠着床前囊胚内细胞团中成功分离了小鼠的胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs),由此建立了最早的胚胎干细胞系。之后人们又陆续分离了人、大鼠等的胚胎干细胞。由于胚胎干细胞具有自我更新和多向分化的生物学特性,所以无论是在生物发育研究方面还是临床医学应用方面都具有非常重要的研究价值。经过前人的大量工作,现在人们已经找到能够在体外长期维持部分胚胎干细胞自我更新状态的方法。但是由于胚胎干细胞维持自我更新是一个极其复杂的生物学过程,因此全面深入的研究胚胎干细胞维持自我更新及分化的调控机制,有利于其广泛而安全的应用。
  目前体外培养胚胎干细胞的培养基主要有两种:一种是LIF/serum培养基;一种是无血清的2i/N2B27培养基:在N2B27中添加CHIR和PD03两种小分子抑制剂(2i)。这两种培养基通过不同的信号通路维持胚胎干细胞的自我更新,LIF/serum主要是通过LIF/STAT3信号通路。本课题组成员之前的研究发现:在众多的LIF/STAT3信号通路的靶基因中,Tfcp2l1是唯一下调之后导致LIF/serum培养条件下的小鼠胚胎干细胞出现分化的基因。这说明了在LIF/STAT3信号通路促进mESCs自我更新的过程中Tfcp2l1占有极其重要的位置。并且人们后来又发现同时过表达Tfcp2l1和klf2可以替代2i维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,所以Tfcp2l1作为多条通路的共同靶基因扮演了十分特殊的角色,但是Tfcp2l1作用的具体机制还不是很清楚。
  为了探究Tfcp2l1在mESCs中调控自我更新的具体机制,我们首先在细胞中下调Tfcp2l1的表达量,检测各个胚层的基因表达,查看其影响了向哪些胚层的分化。结果发现内胚层(endoderm)、中胚层(mesoderm)和滋养层(trophectoderm)的基因发生了明显的上调。为了反向验证这个结果,我们使用可经DOX诱导过表达Tfcp2l1的细胞株i-Tfcp2l1进行了拟胚体(EB)分化,结果显示:在EB形成过程中,诱导Tfcp2l1的表达可以抑制mESCs向内胚层、中胚层和滋养层方向分化。这些研究结果表明Tfcp2l1抑制mESCs向中内胚层以及滋养层细胞方向分化。
  TFCP2L1蛋白结构是其发挥作用的基础,于是我们通过实验分析了TFCP2L1蛋白不同结构域在维持mESCs自我更新方面的作用。首先我们在前人研究的基础上把TFCP2L1蛋白划分成了四个结构域:N-terminus(aa1-20)、CP2-like domain(aa21-242)、SAM domain(aa310-376)和C-terminus(aa377-480)。我们把这些片段一一缺失,构建了四个过表达缺失突变蛋白的mESCs细胞株(△NT、△CP2、△SAM、△CT)进行分化实验。结果显示△NT和△CP2细胞株不能在无LIF条件下维持自我更新。紧接着我们也进行了mEpiSCs(mouse epiblast stem cells,mEpiSCs)重编程回到na(i)ve多能性状态的实验。发现△NT和△CP2突变体不能或极少的使mEpiSCs重编程回na(i)ve状态。以上实验结果说明了N-terminus和CP2-like domain对于Tfcp2l1维持mESCs的na(i)ve多能性非常重要。
  我们在培养缺失突变细胞株的过程中发现△NT和△CP2细胞株在正常LIF/serum培养条件下出现了微分化,进一步的qRT-PCR检测发现△CP2细胞株存在比较高的内胚层基因(Gata4和Gata6)的表达;△NT细胞株则表达了较高的中胚层(T和Mixl)和滋养层的基因(Cdx2和Gata3)。于是我们便寻找导致细胞分化的原因,借以探究Tfcp2l1抑制mESCs向中胚层和滋养层分化的机制。经过一系列的实验我们证明了△NT细胞株向中胚层和滋养层方向分化是由Lef1上调表达引起的,即Tfcp2l1通过抑制Lef1的表达来抑制中胚层和滋养层基因的出现。
  那么Tfcp2l1对于内胚层基因的调节又是通过怎样的途径呢,我们查找资料后发现,MTA家族基因或许起着非常重要的作用。我们通过实验发现MTA家族基因中只有Mta1的下调可以导致过表达Tfcp2l1的mESCs分化,并且是向内胚层方向分化。反之,过表达Mta1能够延缓mESCs分化。免疫共沉淀进一步证明两者蛋白之间存在相互作用。由此我们得到初步的结论,即TFCP2L1通过与MTA1蛋白之间的相互作用调节mESCs内胚层基因的表达。
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