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摘要:为研究桑螟(Glyphodes pyloalis Walker)抗逆生理与肠道微生物的相关性,通过16S rDNA高通量测序技术对高温处理前后的桑螟肠道微生物进行测序,研究桑螟肠道微生物多样性及在高温下肠道微生物的变化对其抗逆生理的作用.温度处理试验表明:在桑螟的肠道菌群门水平上,高温处理后的桑螟肠道中没有检测到酸杆菌门,但新增了梭杆菌门、浮霉菌门和软壁菌门;在属水平上,沃尔巴克菌属的丰度增加了26.38%,变化最大;在桑螟肠道优势菌群中,高温处理后变化最显著的为假单胞菌属,其次为普雷沃菌属,而节细菌属、噬纤维素菌属、埃希菌属、吉氏副拟杆菌属在高温处理后丰度下降,说明高温抑制了杆菌的繁殖,促进了其他菌的繁殖.本研究表明,高温处理后,桑螟肠道微生物的多样性和菌群结构发生了明显的变化,这种变化增加了桑螟的抗逆性,使其更好地适应高温环境....
摘要:桑螟(Glyphodes pyloalis)是蚕区桑园的主要害虫之一,鉴定其抵御各种环境胁迫相关的基因,是制定防治新策略的重要理论依据.对桑螟幼虫转录组数据的分析中,发现桑螟胞外铜锌超氧化物歧化酶(ecCu/ZnSOD)基因在应对高温胁迫时的表达量发生显著变化.为了明确ecCu/ZnSOD在桑螟应对不良环境中发挥的作用,克隆和鉴定了其编码基因GpecCu/ ZnSOD(GenBank登录号:MG566057).GpecCu/ ZnSOD基因的开放阅读框长726 bp,编码241个氨基酸,编码蛋白质序列与脐橙螟(Amyelois transitella)的一种SOD蛋白基因(GenBank登录号:XP_013197347.1)编码氨基酸序列的一致性高达83%.采用邻近相接法构建桑螟与其他昆虫的Cu/ZnSOD系统发生树,结果显示Cu/ZnSOD被分为ecCu/ZnSOD和icCu/ZnSOD两类,主要是随物种进化而进化.采用半定量RT-PCR检测不同温度处理桑螟5龄幼虫的GpecCu/ ZnSOD基因表达情况,结果显示幼虫体内的GpecCu/ZnSOD在高温(40℃)和低温(4℃)条件下表达量最高.构建pCold-GpecCu/ZnSOD重组表达质粒,并在大肠埃希菌中实现异源表达.利用镍柱亲和层析法分离纯化重组GpecCu/ZnSOD蛋白,采用WST-1法测定重组GpecCu/ZnSOD蛋白在40℃时的酶活性最高,并且经60~70℃处理后仍然具有较高的酶活性.采用牛津杯法分析重组GpecCu/ZnSOD的抗氧化活性表明:过表达GpecCu/ZnSOD的大肠埃希菌抗氧化的能力显著增强,显示GpecCu/ZnSOD具有较强的抗氧化功能.研究结果暗示GpecCu/ZnSOD在桑螟应对高温胁迫过程中发挥着重要作用....
摘要:桑螟(Glyphodes pyloalis)是桑树的主要害虫,因其对专用杀虫剂产生了一定抗性,导致防治效果下降.从分子水平研究桑螟对杀虫剂的抗性机制,有利于制定新的防治策略.通过对桑螟中肠转录组数据分析,鉴定了2个细胞色素P450基因CYP9A20和CYP324A 19.系统进化分析表明,桑螟CYP9A20和CYP324A19基因均属于CYP3家族,其中CYP324A 19基因编码氨基酸序列与同属鳞翅目的稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的同源序列亲缘关系比较近,序列相似度为63%;桑螟CYP9A20基因编码氨基酸序列同样与稻纵卷叶螟的同源序列亲缘关系较近,序列相似度高达80%.以浙江省杭州、湖州和海宁3个蚕区桑园采集的桑螟样本提取DNA,经qRT-PCR分析幼虫中肠的CYP9A20基因表达水平没有明显差异,而CYP324A19基因的表达水平存在显著差异,其中来自湖州、海宁的桑螟样本中该基因的表达量分别为来自杭州的桑螟样本的3.2倍、3.0倍.用15 μg/mL辛硫磷和15 μg/mL残杀威处理来自湖州的桑螟幼虫24 h后,qRT-PCR检测CYP9A20基因在幼虫中肠中的表达水平无明显变化,而CYP324A19基因的表达显著上调,辛硫磷、残杀威处理后该基因的表达量分别上调4.0倍、7.8倍.研究结果表明,桑螟的2个细胞色素P450基因在进化上出现了不同分歧,从而导致二者在功能上可能存在明显差异,CYP324A 19基因可能通过上调表达参与桑螟对杀虫剂胁迫的响应过程....
摘要:家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径.将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP4Hα)通过piggyBac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达.利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源pig-gyBac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上.实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在板显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍.利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达....
摘要:家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力,通过利用这一能力,使其能够大量生产有价值的蛋白,人们开始引入转基因家蚕,使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中.获得的重组蛋白可在生物学、生物技术,和药学领域中得到广泛应用.我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位,在后部丝腺(PSG)中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中,在中部丝腺(MSG)中表达则定位于亲水外层的丝胶层中.本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具,应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性,以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景....
[硕士论文] 刘云财
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:高温胁迫是影响昆虫生长和分布的最主要的非生物胁迫之一。桑螟,(Glyphodes pyloalis Walker)螟蛾科(Pyralidae)昆虫,广泛分布于广东、广西、浙江、江苏、云南、四川等蚕业养殖大省,因其对环境适应性强、世代多、繁殖率高的特点,是蚕丝业生产上最为严重的经济害虫之一。本论文运用行为学、转录组学、分子生物学、微生物多样性分析等方法,研究了高温环境下桑螟的躲避行为、高温胁迫后虫体耐热物质代谢变化、耐热相关关键基因的变化以及桑螟肠道的微生物变化等。目的是揭示桑螟适应夏季高温的机制,从而为其科学预警和防控提供理论参考。主要结果如下:
  (1)为了明确桑螟在高温逆境下的生存状况,以桑螟为对象,研究了其在寄主植物桑树上栖息、爬行和取食时的躲避临界高温。将桑螟放在人工气候箱中并经过梯度温度处理(22-37℃),结果显示,在高温环境下桑螟将桑叶折叠的角度减小并且温度越高桑螟将桑叶折叠的时间越短,观察桑螟在桑叶上所处的位置,结果显示在一定温度范围内(20-38℃)桑螟一直处于较高位置的桑叶上,当温度超过38℃时,桑螟会出现在较低位置的叶片上。
  (2)为了研究桑螟应对高温胁迫的分子机制,分别对25℃和40℃处理4h后的桑螟后进行转录组测序分析,拼接共得到34034个基因,其中,在热处理后,1275个基因表达量上调,1222个基因表达量下调。通过表达分析,找到了一些可能参与或介导桑螟耐高温胁迫相关生物途径的主要基因。比如热激蛋白和代谢相关基因,同时,维他命消化吸收通路和14个细胞色素P450相关基因等可能参与桑螟的耐热机制,而免疫和磷脂酰肌醇相关通路也可能与其耐热性有紧密的联系。
  (3)为了从分子水平上探明高温胁迫对抗高温伤害的机制,在从转录组获得桑螟ecCu/ZnSOD核苷酸序列的基础上,克隆了桑螟ecCu/ZnSOD基因,该序列cDNA长725bp序列,编码241个氨基酸。表达模式分析发现,桑螟ecCu/ZnSOD在高温及低温条件下表达量高,属于极端温度表达基因。在大肠艾希菌中表达并纯化了桑螟ecCu/ZnSOD重组蛋白,酶学性质分析表明桑螟ecCu/ZnSOD在40℃时活性最高,采用牛津杯法,研究桑螟ecCu/ZnSOD的抗氧化能力,结果显示表达桑螟ecCu/ZnSOD的大肠艾希菌抗氧化能力显著增强。
  (4)为了从肠道微生物分析桑螟耐高温的原因,通过采用16SrDNA高通量测序技术,对桑螟在不同温度下的细菌群落结构、丰度及演替规律进行深入研究。结果表明:在细菌群落结构的门水平上,变形菌门、放线菌门、绿细菌门是优势种群。在属水平上,正常温度(25℃)条件下,节细菌属、多形杆状菌、沃尔巴克氏菌为主要的优势菌属,其中沃尔巴克氏菌占最大的比例,最高达51.15%;在高温(37℃)条件下,普雷沃菌属迅速增加,成为桑螟肠道内第二大优势菌属。
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