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[硕士论文] 刁志清
生物化学与分子生物学 安徽大学 2015(学位年度)
摘要:生物体正常的生命活动依赖于正常的能量供应。骨骼肌是人体重要的运动器官,消耗了有机体大量的能量,因此骨骼肌又是重要的能量代谢器官。脂质是骨骼肌中储存能量的物质,随时水解出脂肪酸进行β氧化提供能量。骨骼肌中脂质代谢异常会引起胰岛素抵抗,进而发展成为糖尿病。因此,研究骨骼肌中的脂质代谢具有重要的意义。
  骨骼肌中的脂质储存于骨骼肌细胞的脂滴中。脂滴表面由一单层磷脂包围,中心充满了以甘油三酯和胆固醇酯为主的中性脂,单层磷脂膜外分布着许多蛋白质,这些蛋白质赋予了脂滴的多功能性。脂滴不仅与脂质代谢密切相关,还参与了细胞器之间的信息交流,发育,蛋白降解,细胞凋亡,免疫以及病毒的复制。脂滴蛋白质PAT家族中,除了perilipin,其它PAT蛋白质在骨骼肌脂滴上均有表达:ADRP丰度最高,其次是TIP47,S3-12和OXPAT表达量较低。
  TIP47又称M6PRBP1,是在对阳离子依赖的M6PR进行酵母双杂交实验时鉴定出来的,因其分子量大小是47 kDa,与M6PR的尾端结合,因此被命名为47 kDa尾连蛋白(tail-interacting protein of47 kDa)。TIP47与M6PR结合,将M6PR从后期胞内体转运回到反面高尔基体管网状结构上。后来发现,小分子GTPase Rab9可以和TIP47直接相互作用,促进TIP47与M6PR的结合和转运。TIP47是一个广泛表达的蛋白质,在胎盘、卵巢、肾上腺、脑、皮肤、脂肪、肌肉和心脏等组织或器官中均有表达,并且,TIP47在子宫颈癌组织中高表达。目前,TIP47被当作发生子宫颈癌的血液标志和当作子宫颈发育不良与侵润性癌症的生物标志。TIP47也在眼睛中表达,参与眼睛明亮与黑暗的适应反应。另外,TIP47参与肝脏脂肪变性,病毒感染和肿瘤发展过程。
  TIP47与ADRP在氨基酸序列比对上达到43%的同源性。ADRP敲除后,TIP47可以代偿ADRP的功能。TIP47可以从细胞质中募集到脂滴上,与ADRP共同参与新生脂滴的成熟。ADRP的研究较为深入,且已经建立了基因敲除鼠,而TIP47对脂质代谢的研究较少,作用机制远未阐明,既没有建立TIP47敲除细胞系,更没有TIP47基因敲除鼠的报道。因此本研究采用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术,敲除小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12中的TIP47,进一步解释TIP47在小鼠骨骼肌细胞脂质代谢的作用。
  CRISPR/Cas9是细菌抵御外源遗传物质入侵的获得性免疫系统,属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统。经过改良后,可以简便高效地用于真核细胞的基因敲除和基因组编辑,现已广泛应用于动物模型的建立、基因治疗和动植物育种等。其基本原理是Cas9核酸酶在单链指导RNA(sgRNA)的指引下,对特异的双链DNA靶序列进行切割产生双链断裂,随后细胞进行非同源末端连接修复或同源重组修复,导致产生碱基或片段的缺失或插入突变。
  本研究运用改良后的CRISPR/Cas9技术,成功敲除了小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12中的TIP47,并获得了几个TIP47敲除(TIP47 KO)C2C12细胞系。用激光共聚焦扫描显微镜观察LipidTOXTM Red脂滴染色,在正常情况下,与对照组相比,脂滴没有变化,推断TIP47并不影响正常情况下C2C12细胞内中性脂和脂滴的生成。但是用200μM OA处理细胞12小时后,与对照组相比,TIP47KO的C2C12细胞内脂滴变多,说明TIP47可能参与了C2C12细胞在OA刺激下脂质的合成。3H标记OA示踪甘油三酯代谢的实验结果显示,与对照组相比,TIP47 KO的C2C12细胞,其甘油三酯的总量增加了,说明TIP47参与了甘油三酯代谢。另外,免疫印迹杂交的结果,在TIP47 KO的C2C12细胞中,ADRP的蛋白质表达量增加了,这表明,在TIP47 KO的C2C12细胞内,ADRP可能代偿了TIP47的功能。总之,本研究表明,TIP47在C2C12细胞的脂质代谢中起着重要的作用。
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