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[硕士论文] 冯鑫妍
免疫学 大连医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  对生物学实验Western Blot中常用试剂SDS及免疫组织化学技术组织前处理过程和乙醇对抗原、抗体活性及DNA影响进行定量分析,间接反映其对抗原抗体反应可能造成的实验信息的丢失和错误,并试图寻找替代试剂。
  方法:
  1、采用双向免疫扩散实验,通过观察沉淀线及确定抗原效价定量分析SDS处理血清后对血清抗原的影响。
  2、采用免疫散射比浊技术,定量分析SDS处理血清后对IgA、IgM、IgG抗原的影响。
  3、采用电化学发光技术,定量分析SDS处理乙肝表面抗原阳性血清后对乙肝表面抗原的影响。
  4、采用免疫固定电泳技术,分析SDS处理血清后对免疫球蛋白抗原结构的影响。
  5、采用凝集实验,通过比较凝集效价及凝集强度定量分析免疫组织化学组织前处理过程和所应用试剂处理颗粒型抗原后对颗粒型抗原的影响。
  6、采用酶联免疫吸附试验,定量分析SDS及乙醇处理乙肝表面抗体阳性血清后对乙肝表面抗体的影响;定量分析SDS对不同类型患者伤寒及卵清抗体的影响有无差异。
  7、采用荧光定量PCR技术,将DNA模板经SDS及乙醇处理,通过对GAPDH及CRP基因的扩增,比较Ct值,计算实验组与对照组Ct值之差,即△Ct值,及抑制率,定量分析SDS及乙醇对DNA的影响。
  8、通过酶联免疫吸附试验及荧光定量PCR技术测定SDS及十二烷基麦芽糖苷(DDM)对乙肝表面抗体及DNA的影响,并进行比较,探讨DDM在蛋白质提取时,对SDS的替代作用。
  结果:
  1、双向免疫扩散实验结果显示:对照组抗原效价为1:256,SDS37℃实验组抗原效价为1:4,SDS100℃实验组抗原已破坏,结果无沉淀线产生。
  2、免疫散射比浊实验结果显示:SDS37℃实验组IgA、IgM、IgG较对照组略有上升,SDS100℃实验组IgA、IgG抑制率在90%以上,IgM为30%。
  3、电化学发光实验结果显示:SDS37℃实验组乙肝表面抗原抑制率为70%,SDS100℃实验组为96%。
  4、免疫固定电泳技术结果显示:经SDS处理后,免疫球蛋白抗原结构被破坏。
  5、凝集实验结果显示:免疫组织化学技术组织前处理过程对抗原的抑制率为72.2%。各试剂单独处理抗原与对照组相比结果为:75%以上的高浓度乙醇对抗原活性的抑制率约为70%,甲醛抑制率约为20%,二甲苯约为10%。
  6、酶联免疫吸附试验结果显示:SDS对乙肝表面抗体的半数抑制浓度为0.92%(32mmol/L);30%乙醇对HBsAb无明显抑制作用;0.1%SDS对伤寒抗体及卵清抗体具有一定的抑制作用,但是在对ICU患者与健康体检者及不同年龄组健康体检者之间对这两种抗体的抑制作用无明显差异。
  7、荧光定量PCR技术结果显示:SDS及乙醇处理DNA模板后,GAPDH及CRP扩增的Ct值随SDS及乙醇浓度的增加而增加,0.05%(1.74mmol/L) SDS处理后,无扩增曲线。
  8、SDS及DDM对乙肝表面抗体的半数抑制浓度分别为0.92%(32mmol/L)和1.90%(37mmol/L);致使基因不能被扩增出来的处理浓度,SDS为0.05%(1.74mmol/L),DDM在5%(98mmol/L)左右。
  结论:
  1、SDS、免疫组织化学技术组织前处理过程及该过程所应用试剂对抗原、抗体活性及DNA均具有一定的抑制作用,可能造成抗原抗体反应信息的丢失及结果的错误。
  2、DDM对DNA的抑制作用较小,优于SDS。
摘要:我国是肝炎大国,约有一亿三千万慢性乙肝携带者,由于慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素[1],并且在我国每年约有30万人死于肝硬化和原发性肝癌[2]。因此对于乙型肝炎的诊断、治疗显得尤为重要,但是在治疗过程中存在着用药疗程、耐药、停药后复发等一系列问题导致肝炎久治不愈,主要原因之一是由于HBV共价闭合环状 DNA(cccDNA)的存在及消除困难。本文主要对 HBV cccDNA 检测方法及其在临床上应用价值进行阐述。
摘要:拉米夫定是用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物之一,作为临床用药有效果好、副作用少等优点,但长期使用容易产生YMDD变异,进而产生耐药性.本文对近年来有关YMDD变异检测方法及HBV基因型进行综述报道.
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