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摘要:目的:对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力.方法:本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv 三维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显著提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重叠延伸PCR对氨基酸位点进行突变.将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF′,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv.结果:DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLP-scFv DNA片段大小为1 000 bp左右.将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右.结论:成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力....
[硕士论文] 先德群
免疫学 西南医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:胸腺基质细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)于20多年前,被鉴定为小鼠胸腺基质细胞系分泌的一种细胞因子。不久后,相应的人类直系同源基因也被发现。目前,TSLP所介导的信号传导通路已被广泛研究,包括上调多种Th2相关疾病的细胞因子,如:哮喘、遗传过敏性皮炎、超敏反应,甚至有部分癌症也与之相关。所以,TSLP被认为是治疗相关疾病的潜在靶标[1]。自1975年杂交瘤技术问世以来,人们能制备具有良好特异性的单克隆抗体。但由于此类单抗的鼠源性,在用于治疗人类疾病时,会产生强烈的人抗鼠抗体反应(HAMA)[2,3],导致临床应用受到限制。目前的抗体药物领域的研究热点,主要集中于利用基因工程技术,将鼠源抗体进行人源化改造[4-6]。单克隆抗体药物的发展先后经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体四个阶段[7]。本实验平台前期构建大库容量全人源抗体文库和噬菌体展示技术,筛选获得了anti-TSLP-scFv(抗胸腺基质细胞生成素全人源单链抗体),很好的解决了免疫原性问题,但通过此技术获得的抗体亲和力较低[8,9]。本研究通过计算机辅助技术对抗体和抗原进行同源建模,并通过分子对接和分子动力学模拟,预测可以提高抗体亲和力的氨基酸残基,进行定点突变,以促进抗TSLP人源重组抗体的体外亲和力成熟。
  方法:本研究前期,已通过噬菌体展示技术从全人源抗体文库筛选了特异性好的抗TSLP-scFv(84),并通过基因公司测序,获得了该抗体的DNA序列。1.本研究利用计算机辅助技术构建TSLP和抗TSLP-scFv的同源三维模型,并使用分子对接技术进行分子动力学及力场模拟,获得合理稳定的对接模型。通过丙氨酸扫描及单点突变,预测出突变后能提高抗体亲和力的氨基酸位点。2.根据突变位点设计特异性引物,采取重叠PCR原理,对目的片段进行单点突变,获得突变后的抗TSLP-scFv的DNA序列。将突变后的序列与原核表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF'感受肽,表达后通过ELISA筛选出亲和力提升的抗TSLP-scFv菌株。3.将亲和力提升的抗体基因插入真核表达载体PCDNA3.1-sp-Fc和PMH3en,转染HEK-293T细胞,表达抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定获得的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白。4.通过生物大分子相互作用技术检测重组抗体的亲和力。
  结果:1.利用计算机Discovery studio4.5系统,建立TSLP抗原和抗TSLP-scFv三维模型。通过BLAST Search(NCBI Server)搜索到与TSLP和抗TSLP-scFv序列相似度最高的5J11A和4KFZ C(VH)/4HS6A(VL)作为初始模型。通过ZDOCK对蛋白质进行对接计算,基于CHARMm力场能量,使用RDOCK对ZDOCK寻找到的对接复合物构型进行优化。通过分子动力学模拟,获得最终的对接稳定构象Pose50。通过对接表面氨基酸分析,进行丙氨酸扫描及饱和突变,确定虚拟突变后亲和力提升的氨基酸组合为TRP(109)-ARG,TRP(109)-LYS,TRP(109)-TYR,TRP(109)-LEU,TRP(109)-GLU。2.通过突变位点的特异性引物相互配对,扩增出突变点前片段大小约为300bp,突变点后片段大小约为450bp。重叠延伸PCR连接后的抗TSLP-scFv基因片段大小约为750bp。3.将突变后的抗TSLP-scFv基因序列插入表达载体pLZ16,测序验证重组成功的质粒转化E.coli DH5αF'。通过原核系统表达抗TSLP-scFv,ELISA筛选出突变后的M4亲和力明显提升。4.突变前的84和突变后的M4基因序列,成功重组到真核表达质粒PCDNA3.1-sp-Fc和pMH3en,转染HEK-293T细胞后表达的抗TSLP-scFv-Fc融合蛋白,经SDS-PAGE、Western blot鉴定大小约为67KD。5.生物大分子相互作用技术(BIAcore)测定突变后的M4,亲和力较突变前提高了约10倍。
  结论:利用计算机辅助技术,成功促进了抗TSLP重组抗体的体外亲和力成熟。
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