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[硕士论文] 何学松
生物化学与分子生物学 华南师范大学 2010(学位年度)
摘要:人类的核磷蛋白NPM基因定位于染色体5q35。全长约23kb,含12个外显子,编码蛋白的分子量约为38kDa。它是一种多功能蛋白,在肿瘤细胞和干细胞等不断增殖的细胞中表达量较正常细胞多。它具有核定位信号,可以作为分子伴侣在细胞核与细胞质、核质之间穿梭,参与前核糖体颗粒的转运和核糖体的形成。它通过调节中心体的合成以及与p53相互的作用,参与细胞周期调控。在低氧、细胞毒性药物、紫外辐射、病毒蛋白等存在的情况下,过表达NPM,会促使细胞抑制凋亡,促进细胞在逆境下存活。本实验将NPM蛋白与HIV-1病毒TAT蛋白的蛋白转导结构PTD连接,使NPM蛋白具有穿膜结构,利用这个融合蛋白来研究NPM蛋白与p53基因之间的相互作用。实验通过真核昆虫病毒表达体系Bac-to-Bac系统,成功表达出TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,并优化了蛋白表达体系,发现用5μl/ml培养基的病毒感染细胞,D61收集细胞,蛋白表达量最高。western blot检测时发现,昆虫Sf21细胞内也存在NPM蛋白以及蛋白的二聚体。在原核表达体系中表达出TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,并且与真核表达体系比较。发现真核表达蛋白的表达量与纯化量均与原核表达蛋白量与纯化量相当,但真核表达的蛋白比原核表达的蛋白大约1kDa。推测该蛋白在真核表达时,蛋白进行了翻译后的修饰,使得蛋白的分子量加大。因此本实验利用真核系统表达的蛋白,并纯化TAT-NPM和TAT-NPM△C蛋白,将这两个重组蛋白作为外源的药物,分别加入到体外培养的人胚肺成纤维细胞(HLF)中,发现重组蛋白在1h时进入细胞并且保持稳定,重组蛋白进入细胞后,24h仍然保持稳定。用H2O2处理HLF细胞,氧化应激使HLF细胞内p53基因产生应激反应,后检测在这些重组蛋白存在情况下细胞周期的变化。发现相对于对照组来说,在有血清存在的情况下TAT-NPM可以促使HLF细胞从G1期进入S期,在无血清的情况下TAT-NPM和TAT-NPM△c都可使HLF细胞从G1期进入s期。
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