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[硕士论文] 何六一
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是生殖系细胞最早在个体体内出现的,具有精子或卵子发生两个方向的分化潜能。小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)在体外,经上胚层样细胞(epiblast like cells,EpiLCs)阶段,分化成小鼠原始生殖细胞样细胞(mouse PGC-like cells,mPGCLCs),利用唯支持细胞综合征的新生小鼠睾丸细胞与分化得到的mPGCLCs混合培养,在视黄酸、睾酮促性腺激素及垂体提取物等的刺激下,完成减数分裂得到球形精子。虽然可以通过体外分化得到球形精子,但目前的小鼠生殖细胞体外分化系统分化效率低,不能解决目标细胞的大规模获得问题。
  三维细胞培养技术因其在细胞培养过程中更类似体内微环境,能够增大目标细胞的获得量和获得效率,是近年来细胞培养研究的趋势。在哺乳动物生殖细胞分化的过程中尚无关于三维细胞培养技术的相关报道。本实验主要在传统分化体系基础上,在培养基中添加甲基纤维素(methylcellulose,MC),因其粘稠特性减慢了细胞球沉降速率,而形成简单的三维细胞培养状态,并在此基础上优化了分化实验过程,为实现mPGCLCs的大量获得做了初步探索,为进而建立一个体外三维细胞分化体系奠定了重要基础。
  本课题选用共表达BPT(同时有Blimp1、Prdm14和Tfap2c三个转录因子)的转基因mESCs进行体外分化,在EpiLCs和mPGCLCs诱导分化阶段的培养阶段加入0.3%的MC进行三维培养,并优化了EpiLCs阶段的分化培养基。EpiLCs阶段的免疫荧光染色结果显示Oct4的表达符合这一阶段的特征,之后对比传统培养方法,流式细胞荧光分选技术(fluoresvemce activated cell sorting,FACS)分析结果显示改良后的mPGCLCs分化效率未有提高。更进一步的Real-time PCR对day4的mPGCLCs的关键基因表达谱分析,多能性基因和PGCs阶段基因的表达mPGCLCs状态正常,分化效率未有提高,但是水平与传统培养体系的结果相吻合。上述结果说明优化实验流程后得到的统计发现,相同量培养基的条件下mPGCLCs的获得率有4倍左右提高。虽然本项目没有做进一步的功能实验,但是实验结果对体外三维分化体系得到大量目的细胞,提供了最初的方法和技术支持。
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