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[硕士论文] 付三
中药学 湖北中医药大学 2018(学位年度)
摘要:背景:灯盏花素是传统中药灯盏细辛黄酮类有效部位,收载于2015年版《中国药典》一部,其主要成分为灯盏乙素,含量高于90%,由其制作的中成药制剂广泛应用于临床治疗心脑血管疾病,疗效显著,国内外市场十分畅销。目前药典收录的灯盏花素提取纯化工艺采用了大量酸碱处理,会对生态环境造成严重污染。因此对灯盏花素提取纯化工艺进行改革研究,控制其产业化制备对生态环境造成的污染具有重要意义。此外,灯盏乙素能通过调节小胶质细胞的活化发挥抗炎作用,但其作用机制未阐明。因此探讨灯盏乙素抑制小胶质细胞活化的作用机制,可为脑缺血再灌注后损伤治疗策略提供理论依据。
  目的:改革灯盏花素提取纯化工艺,减少酸碱用量,减轻环境污染;探讨其抑制小胶质细胞活化的机制,为其在脑血管方面疾病的治疗作用提供理论基础。
  方法:取灯盏细辛粗粉,按照2015版《中国药典》所示方法,乙醇回流提取,提取液浓缩至1g/mL的含药量。用2mol/L NaOH调节浓缩药液pH至7.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;用5%HCl调节上清液pH至4.5,4℃冷藏,放置过夜,离心,收集上清液;将上清液稀释至0.42g/mL的含药量,通过D101大孔树脂柱,2BV去离子水洗脱除杂,继续用3BV40%乙醇洗脱,收集洗脱液。洗脱液回收乙醇并浓缩至3g/mL的含药量,用5%HCl调pH至2.5,静置,离心。沉淀用适量无水乙醇、去离子水、丙酮反复洗涤,干燥、粉碎后得到粗品。粗品经适量乙醇重结晶,丙酮洗涤,烘干,即得到灯盏花素提取物。使用液相质谱联用仪对所得样品分析鉴定。
  将灯盏乙素作用于LPS诱导活化的BV-2细胞,采用CCK-8法检测灯盏乙素对BV-2细胞存活率的影响。灯盏乙素(10-40μg/mL)预处理BV-2细胞1h,然后加入LPS(1μg/mL)诱导细胞活化。分别采用ELISA法和Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO释放量的影响。提取总RNA,采用实时荧光定量PCR检测灯盏乙素对LPS诱导BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS及COX-2mRNA表达的影响。采用原位免疫荧光染色法检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB核转移的影响。采用Western blot技术检测灯盏乙素对LPS诱导的BV-2细胞NF-κB、MAPK、PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。
  结果:所得灯盏花素提取物经液质联用仪(HPLC-MS)分析,分别鉴定为:灯盏乙素,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷,野黄芩素。其中灯盏乙素含量为94.28%,其转移率为15.6%。
  CCK-8结果表明灯盏乙素(10-40μg/mL)对正常或者LPS诱导的BV-2细胞活力无明显抑制作用。ELISA、NO试剂盒及实时荧光定量PCR检测结果显示:LPS组与对照组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著升高;灯盏乙素(10-40μg/mL)组与LPS组相比BV-2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、NO的释放量及TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2mRNA的表达显著降低。免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,LPS组可观察到NF-κB由细胞质向细胞核的转移,灯盏乙素组与LPS组相比,NF-κB由细胞质向细胞核的转移能明显被抑制。Western blot结果显示:LPS组与对照组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、PI3K、AKT、p38、JNK及ERK蛋白的磷酸化水平显著升高,总蛋白水平无明显变化,IκB总蛋白水平显著下降;灯盏乙素组与LPS组相比,BV-2细胞中p65、IκB、Ikkα/β、AKT、p38、JNK蛋白的磷酸化水平及Ikkβ总蛋白水平显著下降,IκB总蛋白水平显著升高,p65、Ikkα、p38、JNK、ERK、PI3K总蛋白水平及PI3K、ERK蛋白的磷酸化水平无明显变化。
  结论:本研究在《中国药典》收载灯盏花素制备工艺的基础上,对其进行了提取纯化工艺改革研究,取得可靠的技术参数,为其产业化制备工艺改革避免大量酸碱使用提供了实验依据,对于保护生态环境具有重要意义。此外其抑制神经炎症作用机制研究表明,灯盏乙素能通过抑制NF-κB通路的激活,抑制AKT,p38,JNK蛋白的磷酸化来调控相关mRNA的表达,抑制炎症因子的释放,从而抑制小胶质细胞的激活,起到神经保护作用。
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