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摘要:为分析布鲁氏菌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)蛋白的免疫原性,本研究将布鲁氏菌强毒株M28的Cu/Zn-SOD基因经PCR扩增并克隆至pET-32a(+)中进行重组表达和纯化.经western blot分析表明,重组蛋白SOD (rSOD)可以与布鲁氏菌自然感染血清发生特异性反应.同时,以rSOD免疫BALB/c小鼠制备的多抗血清可以与布鲁氏菌疫苗株M5-90发生特异性反应;以rSOD为包被抗原进行间接ELISA检测,结果显示rSOD能够区分布鲁氏菌阳性血清和阴性血清.因此,rSOD蛋白具有良好的免疫原性和ELISA反应原性,为利用rSOD蛋白建立布鲁氏菌检测方法奠定基础....
摘要:为建立山羊布氏杆菌(Brucellar melitensis)血清学检测方法,本实验克隆了B.melitensisM5-90疫苗株的virB12基因,并表达了相应蛋白.经SDS-PAGE和western blot鉴定,重组VirB12蛋白分质量约为25 ku,具有较好的抗原性.以纯化的virB12重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,并检测90份B.melitensis临床血清样品,检测结果与试剂盒及虎红平板凝集试验的检测结果符合率均为91.7%,结果表明,VirB12重组蛋白作为包被抗原可用于B.melitensis感染的血清检测,为进一步建立B.melitensisM5-90 virB12缺失标记疫苗的鉴别检测提供方法....
摘要:以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:山羊传染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)引起的高度接触性传染病,对4株CCPP中国分离株进行分子特征研究,确定其分类地位.针对3段基因(A、B、C),对扩增产物进行酶切鉴定和测序,将结果与丝状支原体簇的6个成员进行遗传衍化分析.在A片段,4株中国分离株的扩增产物经PstI酶切后的结果与Mccp代表株F38相同,为548、420、128等3条带,其他5个丝状支原体簇成员只有420、128 bp两条带.在B片段,序列分析结果显示4株中国分离株与F38同源性为99.5%,与山羊支原体山羊亚种Mcc代表株kid的同源性为98.9%,与丝状支原体山羊亚种MmcZZ株同源性仅为95.4%.在C片段研究发现,4株中国分离株的序列与Mmc模式株PG3株同源性为67.4%~67.6%,与2株Mcc 8601-50和California Kid同源性为95.1%~98.4%,与3株Mccp 97097ET、Gabes和F38的同源性为99.6%~99.8%.通过对中国分离的87001、87002、367、1653等4株CCPP病原体的分子特征研究,首次提出其与山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)亲缘关系最近,应归属为Mccp,并将国内流行的山羊传染性胸膜肺炎的病原定名为Mccp....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA
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摘要:应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性....
[博士论文] 乔祖健
兽医学;基础兽医学 东北农业大学 2019(学位年度)
[硕士论文] 乔祖健
基础兽医学 东北农业大学 2008(学位年度)
摘要:猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(swineEnzooticPneumnoia,SEP)的病原体。SEP亦称猪气喘病(MycoplasmaPneumoniaeofswine,MPS),广泛分布于世界各地,以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染,使死亡率大大提高,给养猪业造成巨大的经济损失。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在疾病控制方面至今未能达到满意的效果。 伴侣蛋白Dnak是猪Mhp的特异性外膜蛋白,该蛋白C端的是其主要的抗原决定簇。本研究依据GenBank中公布的Yin-1基因序列,以猪Mhp中国分离株Yin-1为模板,利用所合成的特异性引物,扩增DnaK基因的C末端,得到1000bp的目的片段。将该序列克隆到pMD-18-T载体上,经PCR、酶切方法鉴定正确后测序,测序结果与GenBank公布的Yin-1标准株的DNA比较,二者同源性达99%以上。并将测序结果正确的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌(DE3)中进行原核表达。将所获得的重组蛋白分别命名为6P-1-DnakC和28a-DnakC。经超声裂解,进行SDS-PAGE分析,表明重组蛋白均主要以可溶形式存在于上清液中,在42kD和65kD处分别获得特异性条带。Western-blot抗原性分析结果表明二者均具有较好的免疫原性。 利用Histag亲和层析柱,对重组蛋白28a-DnakC进行分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE电泳分析,结果显示为单一蛋白条带,纯化效果较好。以6P-1-DnakC作为免疫抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化,免疫8周龄的雌性BALB/C小鼠,每只每次500μg,间隔两周免疫一次,最后一次加强免疫不加佐剂,5d后取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SF2/0进行融合。以纯化28a-DnakC作为包被抗原,用间接ELISA平行筛选阳性克隆,经有限稀释法三次亚克隆后,获得两株能稳定分泌特定性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1AD10和2AF11。生物学特性鉴定表明,腹水单抗1AD10、2AF11的间接ELISA效价分别为1:105和1:104,亚型鉴定分别为IgG2b和lgG2a亚类,且轻链均为k链。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经Western-blot分析表明,两株单抗特异性的针对猪肺支原体Yin-1株65KD和42KD左右的抗原成分。而与其他相关支原体,如丝状支原体丝状亚种SC型标准株(PGI)、丝状支原体丝状亚种LC型标准株(Y-goat)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、猪鼻支原体(Mh)无交叉反应,表明两株单抗为针对猪肺炎支原体的特异性单抗。本试验获得的抗Dnak单抗将为更深入地分析Mhp的结构、功能及生物学诊断提供有力工具。
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