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[博士论文] 丰九英
化学生物学 中山大学 2008(学位年度)
摘要:工业生物催化是生物技术产业化的核心技术,被认为是继医药和农业后生物技术的第三次浪潮,其核心是高效生物催化剂的开发和生化反应过程的分子水平控制。酶作为一种高效生物催化剂,在常温常压和中性pH条件下,能够催化许多化学方法难以完成的反应。而且酶催化效率高、专一性强、可减少或避免副反应、符合绿色化学的要求。但是,由于酶对热、酸、碱、氧化剂、有机溶剂和重金属离子的稳定性差,同时酶在有机介质中的反应效率比在水相中低几个数量级,这些缺陷大大限制了酶的工业化应用。鉴于此,为了开发新型、高效的生物催化剂,作者在查阅并分析了大量国内外文献资料及发展动态的基础上,确立了以结构和性质研究的较为透彻的两种血红素蛋白(辣根过氧化物酶、肌红蛋白)为研究对象,以改善其稳定性和催化功能为研究目标,采用辅因子修饰法对两种蛋白进行了分子水平的改造,从动力学和热力学等多个方面研究了其稳定性和催化性能的改变,并通过波谱的方法对其催化特性得以改善的机制进行深入研究,取得了较为满意的结果。论文主要内容如下: (1)设计和合成了两个人造辅因子HeminD1和HeminD2,即分别在天然辅基血红素heme的每个丙酸基侧链的末端引入一个苯环和一个羧基或一个苯环和两个羧基;并通过电喷雾质谱和紫外-可见吸收光谱对其进行表征。 (2)分别把HeminD1和HeminD2与脱辅基辣根过氧化物酶重组,成功获得两个新颖的重组酶rHRP1和rHRP2。活性试验表明,辅因子修饰提高了辣根过氧化物酶的热稳定性和有机溶剂忍耐性。通过紫外.可见吸收光谱、圆二色光谱、荧光光谱和酶活性四种手段,测定了天然和重组辣根过氧化物酶的热力学参数,天然辣根过氧化物酶的解链温度为70.0℃,辅因子修饰后rHRP1的解链温度提高到75.4 ℃,而rHRP2的解链温度提高到76.5℃。动力学研究表明,辅因子修饰后辣根过氧化物酶在水溶液中和在一些有机介质中对酚类底物的亲和性和催化效率有所提高。这些催化行为的改变可能与活性位点的疏水性、活性位点的扩大及静电排斥等几个因素有关。圆二色及荧光光谱研究表明,辅因子修饰改变了辣根过氧化物酶血红素和色氨酸的微环境,提高了α-螺旋含量和芳香族氨基酸残基周围三级结构的含量。辅因子修饰后辣根过氧化物酶性质上的一些改善可能是由它构象上的变化引起的。对照组实验表明,本文所用的重组条件不会改变辣根过氧化物酶的构象和性质。 (3)通过辅因子修饰法对肌红蛋白进行分子水平的改造,得到两个新颖的重组蛋白rMb-HeminD1和rMb-HeminD2。动力学研究表明,辅因子修饰的肌红蛋白(rMb-HeminD1)在水溶液中对酚类底物的亲和性和催化活性均有所提高,导致催化效率(kcat/Km)提高大约3倍。圆二色及荧光光谱研究表明,辅因子修饰改变了肌红蛋白血红素和色氨酸的微环境,提高了芳香族氨基酸残基周围三级结构的含量。辅因子修饰后肌红蛋白性质上的一些改善可能是由它构象上的变化引起的。对照组实验表明,本文所用的重组条件不会改变肌红蛋白的构象和性质。
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