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[硕士论文] 万思敏
生物学、细胞生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  热休克反应(heat shock response,HSR)是机体在外界环境应激状态下,以大量表达热休克蛋白为特征的适应性保护反应。热休克蛋白通过其分子伴侣活性帮助变性蛋白结构正确折叠或促进变性蛋白降解,从而稳定细胞的蛋白内稳态。热休克转录因子(heat shock factor,HSF)是调控热休克反应的主要转录因子。热休克转录因子通过结合靶基因启动子的热休克元件(HSE)来调控其表达。哺乳类动物共有4个HSF家族成员,Hsf1、Hsf2、Hsf3、Hsf4。而Hsf4具有组织特异性,是晶状体中执行热休克反应的主要转录因子。Hsf4突变导致先天性和老年性白内障的发生,同时小鼠中敲除Hsf4导致晶状体发育异常和白内障。但是,Hsf4调控晶状体分化和白内障发生的分子机制并不清楚。
  CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种天然免疫机制,主要用来对抗入侵细菌的病毒和外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵病毒或质粒的DNA片段整合到CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)中,并利用转录产生相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来引导Cas9蛋白对同源序列的降解,从而保护细菌。CRISPR/Cas9系统能够完成对靶序列的精确酶切,很快被应用到基因编辑中。利用这一原理,设计针对Hsf4的gRNA(guide RNA),引导Cas9蛋白在基因组中预期的位点进行精确酶切。同时,为了筛选方便、快捷,利用细胞内的同源重组修复,导入设计的Hsf4-GFP融合片段为模板,在Hsf4基因切割位点完成同源重组,以获得带有GFP荧光的敲除Hsf4细胞系。
  晶状体中的晶状体上皮细胞在维护晶状体内稳态和维持晶状体功能上发挥着重要作用。有研究发现,年龄老化影响晶状体上皮细胞的终生生长,白内障的发生与晶状体上皮细胞的衰老有关。衰老的晶状体上皮细胞中,与细胞增殖和分化相关的基因NDRG2的上调导致人老年性白内障。Hsf4的失活诱导肿瘤细胞衰老,同时抑制体内肿瘤发生。鉴于Hsf4在晶状体中的功能,Hsf4是否通过调控细胞衰老来维持老年晶状体的功能并不清楚。本课题利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠晶状体上皮细胞Hsf4,探讨Hsf4缺失导致细胞衰老的分子机制。
  目的:
  利用CRISSPR/Cas9系统在晶状体上皮细胞中敲除小鼠Hsf4基因研究Hsf4调控晶状体细胞衰老的分子机制。
  方法和结果:
  1.首先,我们成功构建针对小鼠Hsf4基因的CRISPR/Cas9 gRNA质粒和小鼠Hsf4-GFP融合片段质粒。为增加切割效率,我们在Hsf4编码区ATG下游设计了2个gRNA位点。
  2.之后,将小鼠Hsf4的两个CRISPR/Cas9 gRNA质粒和小鼠Hsf4-GFP融合片段质粒共转入小鼠晶状体上皮细胞(mLEC)中。
  3.通过PCR扩增切割位点基因组序列,western blot检测Hsf4下游基因的表达水平,以及观察细胞的绿色荧光情况,证明Hsf4基因在设计位点处发生重组。
  4.通过有限稀释法和单克隆培养法筛选Hsf4带有绿色荧光的Hsf4敲除单克隆细胞株。
  5.利用western blot检测绿色荧光单克隆细胞中GFP、Hsf4下游基因hsp25、αB-crystallin的表达情况,发现GFP在单克隆细胞中高表达,Hsf4下游基因明显下降,这表明单克隆细胞中Hsf4已经敲除。
  6.为证明Hsf4是否参与细胞衰老过程,我们分别利用β-半乳糖苷酶染色实验、衰老相关异染色质点(SAHF)检测、MTS检测细胞增殖来确定Hsf4敲除是否导致晶状体上皮细胞衰老。我们的结果显示, Hsf4敲除后,β-半乳糖苷酶染色明显增强, SAHF增多,细胞增殖减缓,这些数据表明Hsf4敲除导致晶状体上皮细胞衰老。
  7.p21和p16是细胞衰老过程中的主要调控因子,因此为探究Hsf4调控细胞衰老的分子机制,我们检测了Hsf4敲除细胞中二者的表达情况。western blot检测发现衰老相关基因p16表达不变,而p21的表达明显增加,同时q-PCR检测发现p21 mRNA水平明显增加。
  8.为体内验证Hsf4在晶状体细胞衰老中的作用,我们收取了青年和老年小鼠的晶状体组织。利用realtime PCR检测发现,小鼠老年晶状体中热休克反应能力明显降低、Hsf4 mRNA水平下降、同时p21 mRNA水平明显增高。
  结论
  通过CRISPR/Cas9系统在mLEC细胞中成功构建小鼠Hsf4敲除细胞系,并且细胞中Hsf4基因的敲除会导致晶状体上皮细胞衰老,细胞内p21的表达量上升。
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