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一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法
摘要: 本发明公开了一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法。以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板PCR处理获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物;利用家蚕核型多角体病毒BmNPV作为载体,构建了含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组病毒,利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主表达具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白A链。本发明以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白A链,具有较强的生物活性,有利于蛋...   查看全部>>
  • 专利类型:
    发明专利
  • 申请/专利号:
    CN201910345204.1
  • 申请日期:
    2019-04-26
  • 公开/公告号:
    CN110129332A
  • 公开/公告日:
    2019-08-16
  • 主分类号:
    C12N15/29(2006.01)  C  C12  C12N  C12N15 
  • 分类号:
    [C12N15/29(2006.01), C12N15/866(2006.01), C07K14/415(2006.01), C07K1/22(2006.01), C12N15/29, C12N15/866, C07K14/415, C07K1/22]
  • 申请/专利权人:
  • 发明/设计人:
  • 主申请人地址:
    310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
  • 专利代理机构:
    杭州求是专利事务所有限公司
  • 代理人:
    林超
  • 国别省市代码:
    浙江;33
  • 主权项:
    1.一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于: (1)蓖麻毒素蛋白A链编码基因的克隆:以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板,利用RT-PCR系统一步克隆获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物; (2)含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组杆状病毒的构建:用限制性内切酶BamHI和HindIII消化PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A链得到蓖麻毒素蛋白A链基因片段,然后将蓖麻毒素蛋白A链基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisA获得重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链;通过共转染在家蚕培养细胞BmN内将重组体pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的基因同源重组产生重组病毒; (3)家蚕体内表达重组蓖麻毒素蛋白A链:使用家蚕幼虫5龄起蚕,经口接种上述重组病毒进行感染表达,将涂布有病毒液的桑叶饲喂家蚕,然后在23-25℃下饲养;在饲养96小时后收集家蚕幼虫;从家蚕幼虫中收集血淋巴,用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化,获得最终的重组蓖麻毒素蛋白A链蛋白。 2.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,利用RT-PCR系统一步克隆具体如下:引物设计如下:正向引物:5'-AGGGATCCCCATTCCCCAAATA-3',含有BamHI酶切位点,反向引物:5'-GAAGCTTTAAAAACTGTGACGATGGT-3',含有HindIII酶切位点;PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下:一个循环,94℃模板变性2分钟;10个循环,94℃变性10秒,57℃退火30秒,68℃延伸1分钟;25个循环,94℃变性10秒,57℃退火30秒,68℃延伸1分钟;最后1个循环,68℃延伸7分钟;然后利用1%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析,并用PCR纯化试剂盒纯化,随后将PCR产物克隆入载体PCR2.1,获得PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A链。 3.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于:所述步骤(1)中,载体PCR2.1为Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体PCR2.1。 4.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于:所述步骤(2)具体为:在离心管中加入1μg的pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A链DNA和15μg的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA,混匀,并加入14μl的脂质体(lipofectin),再加入灭菌蒸馏水至终体积40μl,获得混合物;然后将混合物在常温培育15分钟后共转染对数生长期的BmN培养细胞,用无血清的TC-100培养基培养24小时后,换成含有10%胎牛血清的新鲜培养基在27℃培养5天,收集培养基上清作为病毒储存原液,用病毒储存原液通过空斑筛选,最终获得重组病毒溶液,浓度为108pfu/ml。 5.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,以家蚕幼虫的血淋巴作为重组蓖麻毒素蛋白A链纯化的起始材料,具体使用以下方法从家蚕幼虫中收集血淋巴:收集管预先加入占据收集管1/10体积的10mmol/L的二硫苏糖醇DTT(分子式为C4H10O2S2),在收集管的上方,将幼虫向背面弯曲,用一只手固定幼虫的头部和尾部,让腹部和腹足伸向外边;用25号针头刺破腹足收集血液,让血液直接滴进收集管中。 6.根据权利要求1所述的一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化,具体为:将收集的血淋巴用非变性结合缓冲液进行稀释,非变性结合缓冲液含有Na3PO4 50mmol/L、NaCl 0.5mol/L且pH8.0,稀释后将溶液结合于Ni-NTA亲和柱,再在非变性结合缓冲液中加入250mmol/L咪唑获得非变性洗脱缓冲液,用非变性洗脱缓冲液洗脱,收集洗脱液作为重组蓖麻毒素蛋白A链蛋白的溶液。
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